El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas
Summary
Dos técnicas para aislar las gotas de lípidos celulares de 1) las células de levadura y 2) se presentan placentas humanas. La pieza central de ambos procedimientos es la centrifugación en gradiente de densidad, donde la capa flotante resultante que contiene las gotas puede ser visualizado fácilmente por el ojo, se extrae, y se cuantifica por análisis de Western Blot para la pureza.
Abstract
Gotitas de lípidos son orgánulos dinámicos que se pueden encontrar en la mayoría de las células procariotas eucariotas y ciertos. Estructuralmente, las gotitas consisten en un núcleo de lípidos neutros rodeadas por una monocapa de fosfolípidos. Una de las técnicas más útiles en la determinación de las funciones celulares de las gotitas ha sido la identificación proteómico de las proteínas unidas, que pueden aislarse junto con las gotitas. Aquí, dos métodos se describen para aislar las gotas de lípidos y sus proteínas unidas a partir de dos amplias eucariotas: la levadura de fisión y células vellosidades placentarias humanas. Aunque ambas técnicas presentan diferencias, el método principal – la densidad gradiente de centrifugación – es compartido por ambas preparaciones. Esto demuestra la amplia aplicabilidad de las técnicas de aislamiento de gotitas presentados.
En el primer protocolo, las células de levadura se convierten en esferoplastos por digestión enzimática de sus paredes celulares. Los esferoplastos resultantes se gently lisaron en un homogeneizador holgada. De Ficoll se añade al lisado para proporcionar un gradiente de densidad, y la mezcla se centrifugó tres veces. Después de la primera vuelta, las gotitas de lípidos se localizan en la capa flotante de color blanco de los tubos de centrífuga junto con el retículo endoplásmico (ER), la membrana plasmática, y vacuolas. Dos giros posteriores se utilizan para eliminar estos otros tres orgánulos. El resultado es una capa que tiene sólo gotitas y las proteínas unidas.
En el segundo protocolo, las células de las vellosidades placentarias están aisladas de placentas plazo humano por digestión enzimática con tripsina y DNasa I. Las células se homogeneizaron en un homogeneizador holgada. Pasos de baja velocidad de centrifugación y de velocidad media se utilizan para eliminar las células sin lisar, los desechos celulares, núcleos, mitocondrias y. La sacarosa se añade a la homogeneizado para proporcionar un gradiente de densidad y la mezcla se centrifuga para separar las gotitas de lípidos de la otra cellulafracciones r.
La pureza de las gotas de lípidos en ambos protocolos se confirma mediante análisis Western Blot. Las fracciones de gotas de ambas preparaciones son adecuadas para el análisis proteómico y lipidomic posterior.
Introduction
Las gotas de lípidos celulares son orgánulos dinámicos que sirven múltiples funciones en las células. Ellos son centros de almacenamiento de lípidos neutros, que se pueden transformar en energía o utilizados para la síntesis de fosfolípidos. Las gotitas juegan un papel central en condiciones fisiológicas y patológicas incluyendo la aterosclerosis, la obesidad, y enfermedades metabólicas relacionadas, y también enfermedades infecciosas 1,2. Además, son fuentes interesantes para los combustibles de biodiesel.
Mucha información sobre las funciones celulares de las gotas de lípidos se ha obtenido a partir del análisis proteómico y lipidomic de gotas purificadas de microorganismos de amplio alcance 3. Estos organismos han incluido las bacterias, levadura 4,5 6-11, plantas 12,13, nematodos 14, y vuela 15,16. Dado el interés en el papel de gotitas de lípidos en enfermedades metabólicas humanos, las gotitas también se han aislado a partir de células animales cultivadas y untejidos Nimal. Líneas de células cultivadas han incluido adipocitos 3T3-L1 17, de ovario de hámster chino (CHO), las células K2 18, hepatocitos humanos 19,20, y líneas de células epiteliales 21. Tejidos animales de la que se han aislado las gotas han incluido ratón músculo esquelético 22, 23 de hígado y las glándulas mamarias 23. Como se mencionó anteriormente, el objetivo de la mayoría de los estudios de aislamiento gotita es para llevar a cabo el análisis proteómico de los factores unidos y análisis lipidomic en el neutro y fosfolípidos.
Desde lípidos neutros – el componente más numeroso de gotitas de lípidos – son menos densos que la mayoría de otros materiales celulares, el aislamiento de las gotas que tradicionalmente se ha realizado utilizando la densidad gradiente de centrifugación. Esa técnica es la pieza central de las dos preparaciones que se presentan aquí. Las técnicas anteriores se combinan 6,24 y modificar en una presentación visual de la aislamiento de gotitas a partir de células de levadura de fisión cultivadasy células humanas culturalizado obtuvieron a partir de tejido placentario. El objetivo es mostrar la amplia aplicabilidad de esta técnica por la elección de dos tipos de células muy diferentes como puntos de partida para el aislamiento de las gotitas. Esta técnica debe ser útil para aquellos que deseen para aislar las gotitas de la mayoría de los organismos.
Protocolo 1 describe el aislamiento de gotitas de lípidos de la levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe, que ha sido utilizado como un modelo para la observación de la formación de gotas durante la división celular eucariota 25. La levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae se ha usado ampliamente como un organismo modelo para el estudio de la biología de los lípidos de las gotitas. Protocolo 1 es aplicable tanto a los organismos y las diferencias en los preparativos se destacan.
Protocolo 2 describe el aislamiento de gotas de lípidos de las células de las vellosidades placentarias, que son a su vez obtenida de placenta humana a término. Lacolección de placentas plazo proporciona una oportunidad única de obtener seguridad y ética de 200-250 g de tejido humano disponible el 26, que contiene una cantidad significativa de las gotas de lípidos. Esto está en contraste con la mayoría del trabajo de aislamiento gotas de lípidos en eucariotas superiores, donde las gotitas se originan a partir de células cultivadas. En esos estudios, los ácidos grasos se añaden a menudo a la cultura para promover la síntesis de lípidos neutros y por lo tanto el crecimiento de las gotitas. Esto es en contraste con el trabajo aquí donde las gotas de lípidos se forman bajo condiciones nativas en el tejido de la placenta.
Las purezas de las fracciones de gotas de lípidos se determinaron por análisis de Western Blot utilizando anticuerpos marcadores de orgánulos. Estas dos fracciones protocolos producirán gotitas de lípidos que son adecuados para el análisis proteómico y lipidomic posterior.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos dentro de este protocolo
Asegúrese de que para ser consistente con los medios de comunicación y las densidades de células durante el crecimiento de las células cultivadas. Gotitas de lípidos celulares son únicos en que sus proteínas asociadas son depende en gran medida el medio ambiente en el que se cultivan las células 17. Por lo tanto, los medios de comunicación en el que se cultivan las células y la densidad …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el premio de la Asociación Americana del Corazón 13SDG14500046 a PD, una Escuela de Energía Sostenible y Premio de Investigación Centro (Universidad de Tennessee) a PD, y para la Educación Médica de los Médicos y la Fundación para la Investigación (Universidad de Tennessee) premio a JM La autores agradecen a Caroline Leplante (Yale Univ.) para el protocolo para la conversión de la levadura de fisión para esferoplastos; Eric T. Boder (Universidad de Tennessee) para el uso de sus incubadoras temblores, centrífuga de mesa y Western Blot equipos de análisis, y el Centro de Biotecnología Ambiental (Universidad de Tennessee) para el uso de su ultra-centrífuga; Günther Daum para anticuerpos levadura (Graz University of Technology, Austria.); al personal del Departamento de Obstetricia y Ginecología (Univ. Tennessee Medical Center) para la asistencia técnica .
Materials
| PROTOCOL #1: | |||
| 1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 liter glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 liter flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| PROTOCOL #2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml beakers | |||
| 15 ml centrifuge tubes | |||
| 10 ml serological pipettes | |||
| 50 ml centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
| NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
| perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
References
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
