Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain'ler Görselleştirme
Summary
Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.
Abstract
Bu yoğun interorganelle moleküler trafik rağmen ayırt edici bileşimin ve fonksiyonlarını muhafaza rağmen ökaryotik hücrelerde lipidler ve proteinlerin sürekli hücre bölmelerine arasında değiş tokuş edilir. Bu yazıda anlatılan teknikler in vivo ve fizyolojik ortamda protein ve lipid hareketlilik ve kaçakçılığı okuyan güçlü araçlardır. (FLIP) Photobleaching içinde (sıkı bağlamak) ve floresan kaybı photobleaching sonra floresan kurtarma yaygın exo-endositik yolu, organellere veya alt bölme arasındaki süreklilik, protein komplekslerinin oluşumu ve protein yerelleştirme yoluyla hücre içi ticaretini incelemek için canlı hücre görüntüleme teknikleri kullanılır Lipid mikro bölgeleri olarak, her biri, fizyolojik ve patolojik koşullar altında gözlemlenebilir. Bu yaklaşımların sınırlamaları nedeniyle floresan füzyon proteinlerinin kullanımı ile esas olarak ve potansiyel sakıncaları aşırı ifade suni içerirhücrelerde iyonu ve etiketli ve yerli protein katlanması ve lokalizasyon farklılıklar olasılığı. Son olarak, optik mikroskopi (yaklaşık 200 nm) çözünürlük limiti olarak stres altında hücrelerde kaynaklı olabilir ER veya belirli bir alt bölme ve ince yapısı soruşturma izin vermez (örneğin, hipoksi, ilaç uygulama, transmembran aşırı ifadesi ER ikamet proteinler) ya da patolojik koşullar altında, ultrastrüktürel ile kültür transfekte edilmiş hücrelerin canlı hücre görüntüleme kombine transmisyon elektron mikroskobu göre analiz eder.
Introduction
Yeşil floresan proteininin (GFP) ve spektral varyantları, ve floresan mikroskopi paralel gelişme keşif, hücrelerin protein davranış soruşturma için tamamen yeni yollar açtı. Çünkü yoğun bir aydınlatma altında floresan söndürmek için Flüoroforlann içsel kapasitesinin mümkündür (FLIP), ışıkla in (sıkı bağlamak) ve floresan kaybı photobleaching sonra floresan kurtarma gibi teknikler, konfokal canlı hücre görüntüleme dayalı ve kullanımı transfekte floresan füzyon proteinleri 1-3. Çıktıkları fonksiyon 4 ile ilgili önemli ipuçları ortaya çıkarabilir proteinlerin lokalizasyonu, aynı zamanda onların hareketlilik ve veziküler taşıma, sadece değerlendirmek için kullanılır.
Ökaryotik hücrelerin benzersiz özelliği spesifik lipid ve protein bileşimleri olan hücre içi bölmelerin varlığıdır. Organelleri fiziksel isolat rağmened, birbirleriyle iletişim ve hücresel homeostazı sürdürmek için moleküler bileşenleri paylaşmak gerekir. Salgı yolu ER sentezlenen proteinler ve lipidler onların işlevini uyguladıkları doğru son hedefe ulaşmasını garanti eder. Hücre içi organelleri de moleküller (lipidler) doğrudan bölmeleri arasında değiş tokuş edilmesine izin dinamik iletişim siteleri tarafından bağlanabilir. Ayrıca, birçok protein büyük heteromerik komplekslerine asamblajı ya da işlevsel olarak aktif olmaya ya da nihai hedefe taşınması amacıyla özel lipid türleri (lipid sal / mikro bölgeleri) ile bağlantılı olması. Bu biyolojik açıdan tüm büyük proteinlerin kinetik özelliklerini etkileyen ve bu nedenle, uygun bir şekilde aşağıda tarif edilen teknikler vasıtasıyla incelenebilir.
Grubumuz ER mimarisi ve farklı alt incelemek için yaygın olarak kullanılan sıkı bağlamak ve elektron mikroskobu ile birlikte FLIPetki. ER salgı yolunun ilk istasyonu ve protein ve lipid 5 sıralama önemli bir rol oynar. Bu kimin ayrı alt alan birçok farklı işlevleri (yani protein ve lipit biyosentezi ve ticareti, protein katlanması, Ca 2 + depolama ve serbest ve ksenobiyotik metabolizma) yansıtan son derece dinamik bir organelidir. Bu uzaysal olarak, morfolojik, ve fonksiyonel olarak farklı olmasına rağmen, ancak, bu etki birbirleri ile süreklidir ve bunların nispi bolluk fizyolojik ve patolojik koşullar altında hücrelerde değiştirilebilir. Iyi bilinen ve ER genellikle mekansal ayrılmış alanlar nükleer zarf ve pürüzsüz ve pürüzlü ER olmakla birlikte, biz ve diğerleri ER yapı, çeşitli hücre tiplerinde daha ayrıntılı mimari ve üç boyutlu organizasyon ile olduğunu göstermiştir ve var Ayrıca, hipoksi, ilaç olarak stresli uyaranlara vasıtasıyla tahrik edilebilir, fizyolojik koşullar altında dokularınuygulama veya ER-yerleşik transmembran proteinlerin 2,6 arasında aşırı ekspresyonu (ve buradaki referanslar).
Ayrıca son zamanlarda insan hastalıklarının 1,7 hücre modellerinde bu tür yapıların varlığını göstermiştir. Pürüzsüz ER yığılmış sisternalarında kaynaklanan onlar da kendi mimarlık temelinde karmellae, lameller ve kristalloid ER olarak bilinmesine rağmen, onlar, 2003 6 düzenlenen düz endoplazmik retikulum (OSER) kolektif adı verildi, hangi gibi onların boyutu, değişebilir. Hücreler kuyruk demirlemiş (TA) ER-yerleşik proteinler (d EGFP-ER), trans GFP zayıf dimerize eğilimi dramatik ER organizasyon ve yapısını değiştirir sitozolik bölgeye kaynaşmış GFP ile transfekte sonra. Sıkı bağlamak ve FLIP deneyler d EGFP-ER OSERs içinde yayılmak için serbest olduğunu gösterdi ve OSER için retiküler ER hareket eder ve tersi <gerçeği/ Em> agrega çevreleyen retiküler ER sürekli olduğunu göstermektedir. Ultrastrüktürel analizi bize nano düzeyde OSER mimarlık ve örgüt ayrıntılı bir açıklama ile floresan veri ilişkilendirmek için izin verdi: OSERs her zaman düzgün ER eşleştirilmiş sisternalarında yığınlarının kadar yapılır ama böyle düzenli sinüs düzenlenmiş gibi mekansal organizasyon farklı biçimlere sahip olabilir diziler veya ağırşak, veya altıgen "kristalloid" boru şeklinde diziler. Bu yeniden düzenlemeler de fizyolojik koşullar 9 ve hipoksi 10, 11, ilaç tedavisi ve kanser 9 Aşağıdaki gibi stresler altında hücrelerde bulunan edilmiş olarak, ultrastrüktürel marker olarak önemli bir potansiyele sahip olabilir, kübik morfolojileri 8 yol açar.
GFP füzyon proteinleri kullanılarak bu ilk gösteri sonra, farmakolojik tedavilere 12, asse tepki olarak ER etki proliferasyonunu analiz etmek için kullanılan deneyler görüntülemep hücreleri 13 oligomerize etmek, ve 1,8 patojenite ile ilgili olabilir ER kaynaklı hücre içi agrega oluşumunda bir mutant, ALS TA-bağlantılı protein rolünü araştırmak için floresan protein eğilimidir. Bu, (çok sayıda nörodejeneratif hastalıkların 14 oluşur) hücre içi agrega oluşumu toksik mutant proteinleri ve çevreleyen hücre bileşenleri 15 arasındaki etkileşimleri önlemek için tasarlanan bir koruyucu mekanizma olabileceğini öne sürülmüştür.
Aşağıda olan C-terminal hidrofobik alanları, ER'nin zarı içine sokulur ve dinamik davranış bir analiz ve ER alanı üzerindeki aşırı ifade yapıları etkileri araştırmak için, optik ve elektron mikroskopi yöntemlerin bir kombinasyonu bir açıklamasıdır kültürlenmiş hücrelerde mimarisi (deney protokolünün bir akış şeması için Şekil 1'e bakınız).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda anlatılan protokoller ve görüntüleme yaklaşımlar canlı hücrelerin ER ikamet transfekte TA floresan proteinlerinin dağılımını ve hareketliliği araştırmak için kullanılmıştır. Ayrıca mikroskobik analizler vasıtasıyla bu hücre içi bölmesinin mimarisi bu proteinlerin aşırı ifadesinin etkisini analiz ettik.
Canlı hücre konfokal görüntüleme ve elektron mikroskobu birleşimi proteinlerin dinamik özelliklerini araştıran bir çok güçlü bir araç old…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bu yazının yayınlanmasından onun yardım ve destek için Fondazione Filarete minnettarız. Biz de Tecnai G2 transmisyon elektron mikroskobu kullanımı için Centro Europeo di Nanomedicina teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehyde Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Science | 19150 | |
| Uranyl Acetate dihydrate | Sigma Aldrich | 73943 | slightly radioactive |
| Propylene Oxide | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON embedding medium kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Lead Citrate | Electron Microscopy Science | 17800 | |
| Bench top centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Microscope Cage Incubation System | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| steel culture cell chamber for 24 mm coverslip | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Electron Microscopy grids | Electron Microscopy Science | G300Cu |
References
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).
- Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).
- Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and. 20, 87-123 (2004).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).
- Papiani, G., et al. Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome. J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).
- Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization. J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).
- Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. The dynamic ER: experimental approaches and current questions. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).
- Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 12, 327-342 (1994).
- Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital. Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).
- Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells. J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13, 643-649 (2012).
- Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres. J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
- Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. EMBO J. 27, 336-349 (2008).
- Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways. Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
- Michida, T., et al. Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).
