Visualisering av endoplasmatiskt retikulum Domäner i odlade celler
Summary
Vi beskriver avbildning vi använder för att undersöka spridning och rörlighet för de transfekterade fluorescerande proteiner bosatta i det endoplasmatiska retiklet (ER) med hjälp av den konfokala avbildning av levande celler. Vi också ultrastrukturellt analysera effekten av deras uttryck i arkitekturen i denna subcellulära fack.
Abstract
De lipider och proteiner i eukaryota celler ständigt byts ut mellan cell fack, även om dessa behåller sin distinkta sammansättning och funktioner trots det intensiva interorganelle molekylära trafik. De tekniker som beskrivs i detta dokument är kraftfulla medel för att studera protein och lipid rörlighet och handel in vivo och i deras fysiologiska miljö. Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) och fluorescens förlust i fotoblekning (FLIP) används ofta levande cellavbildningstekniker för att studera intracellulära människohandel genom exo-endocytic vägen, kontinuiteten mellan organeller eller underutrymmena, bildandet av proteinkomplex, och protein lokalisering i lipid mikroområden, som alla kan observeras under fysiologiska och patologiska tillstånd. Begränsningarna av dessa metoder är främst på grund av användningen av fluorescerande fusionsproteiner, och deras eventuella nackdelar inkluderar artefakter över expressjon i celler och möjligheten att skillnader i veckning och lokalisering av märkta och nativa proteiner. Slutligen, eftersom gränsen för upplösningen av optisk mikroskopi (ca 200 nm) inte tillåter undersökning av den fina strukturen hos ER eller de särskilda underutrymmena som kan ha sitt ursprung i celler under stress (t.ex. hypoxi, läkemedelsadministrering, överuttryck av membran ER bosatta proteiner) eller i enlighet med sjukdomstillstånd, kombinerar vi live-cell imaging av odlade transfekterade celler med ultraanalyser baserade på transmissionselektronmikroskop.
Introduction
Upptäckten av grönt fluorescerande protein (GFP) och dess spektrala varianter, och den parallella utvecklingen av fluorescensmikroskopi, har öppnat upp helt nya möjligheter för undersökning av protein beteende i celler. Tekniker såsom fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) och fluorescensförlust i fotoblekning (FLIP), vilket är möjligt på grund av den inneboende förmågan av fluoroforer för att släcka sin fluorescens under intensiv belysning, är baserade på konfokal live-cell imaging och användningen av transfekterade fluorescerande fusionsproteiner 1-3. De används för att bedöma inte endast lokaliseringen av proteiner, men även deras rörlighet och vesikulär transport, som kan avslöja viktiga ledtrådar beträffande deras funktion 4.
Det unika med eukaryota celler är närvaron av intracellulära fack som har specifika lipid-och proteinkompositioner. Även om organeller är fysiskt isolated, de behöver för att kommunicera med varandra och dela med molekylära komponenter för att upprätthålla cellulär homeostas. Den sekretoriska vägen garanterar att proteiner och lipider syntetiseras i ER nå rätt slutdestination där de utövar sin funktion. Intracellulära organeller kan också anslutas genom en dynamisk kontakt webbplatser som tillåter molekyler (lipider) vara direkt utbytas mellan fack. Dessutom har många proteiner har att monteras i stora heteromera komplex eller förknippad med specifika lipid arter (lipid flottar / mikroområden) för att bli funktionellt aktiva eller transporteras till slutdestinationen. Alla dessa biologiska aspekter kraftigt påverka de kinetiska egenskaperna hos proteiner, och kan därför på lämpligt sätt undersöktes med hjälp av de tekniker som beskrivs nedan.
Vår grupp har i stor utsträckning används FRAP och FLIP kombination med elektronmikroskop för att studera strukturen för ER och dess olika underdomäner. ER är den första stationen i den sekretoriska vägen och spelar en viktig roll i protein och lipid sortering 5. Det är en mycket dynamisk organell vars distinkta subdomäner reflekterar dess många olika funktioner (dvs. protein och lipid biosyntes och människohandel, proteinveckning, Ca2 + lagring och uttag, samt xenobiotiska ämnesomsättning). Emellertid, även om de är morfologiskt, rumsligt och funktionellt distinkt, dessa domäner är kontinuerliga med varandra, och deras relativa förekomst kan modifieras på celler under fysiologiska och patologiska tillstånd. Den mest kända och oftast rumsligt segregerade områden av ER är kärnhöljet, samt en harmonisk och grov ER, men har vi och andra visat att det finns ER strukturer med en mer utarbetad arkitektur och tredimensionell organisation i olika celltyper och vävnader under fysiologiska betingelser som också kan induceras med hjälp av stressande stimuli, såsom hypoxi, narkotikaadministration, eller överuttryck av ER-bosatt transmembranproteiner 2,6 (och referenser däri).
Vi har också nyligen påvisat sådana strukturer i cellmodeller för mänskliga sjukdomar 1,7. Med ursprung från den staplade cisternae av släta ER, fick de samlingsnamnet organiserade släta endoplasmatiska nätverket (OSER) 2003 6, även om de är även känd som karmellae, lameller, och kristalloid ER utifrån sin arkitektur som, liksom deras storlek kan variera. När cellerna transfekterade med GFP smält till cytosoliska regionen i svansen förankrade (TA) ER-bosatt proteiner (d EGFP-ER), den svagt dimerisering av tendensen av GFP i trans förändrar dramatiskt organisation och struktur av ER. FRAP och FLIP experiment visade att d EGFP-ER är fri att diffundera inom OSERs, och det faktum att den rör sig från det retikulära ER till OSER och omvänt </ Em> indikerar att aggregaten är kontinuerlig med den omgivande retikulära ER. Ultra analys har gett oss möjlighet att korrelera fluorescens data med en detaljerad beskrivning av OSER arkitektur och organisation på nanonivå: OSERs alltid består av högar av parade cisternae av släta ER, men kan ha olika former för fysisk planering, som regelbundet arrangeras sinus arrayer eller virvlar, eller sexkantiga "kristalloida" rörformiga arrayer. Dessa omlagringar leda till kubiska morfologier 8 vilket, som de har visat i celler under fysiologiska betingelser 9 och följande spänningar såsom hypoxi 10, läkemedelsbehandling 11, och cancer 9, kan ha en betydande potential som ultrastrukturella markörer.
Efter denna första demonstrationen med hjälp av GFP fusionsproteiner, använde vi imaging experiment för att analysera spridningen av ER-domäner som svar på farmakologisk behandling 12, Assess tendens fluorescerande proteiner att oligomerise i celler 13, samt att undersöka rollen av en mutant, ALS-kopplade TA protein i bildandet av intracellulära aggregat av ER ursprung som kan vara relevanta för dess patogenicitet 1,8. Det har föreslagits att bildandet av intracellulära aggregat (som förekommer i många neurodegenerativa sjukdomar 14) kan vara en skyddsmekanism som syftar till att förhindra interaktioner mellan giftiga muterade proteiner och de omgivande cellkomponenter 15.
Vad som följer är en beskrivning av en kombination av optiska och elektronmikroskopiska metoder för att undersöka konstruktioner vars C-terminal hydrofoba domäner in i membranet av ER, och en analys av deras dynamiska beteende och effekterna av deras överuttryck på ER domän arkitektur i odlade celler (se figur 1 för ett flödesschema över det experimentella protokollet).
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen och avbildning som beskrivs i detta dokument har använts för att undersöka spridning och rörlighet för transfekterade TA fluorescerande proteiner bosatta i ER av levande celler. Vi har också analyserat effekten av överuttryck av dessa proteiner på arkitekturen av denna subcellulär avdelning med hjälp av ultrastrukturella analyser.
Kombinationen av live-cell konfokala imaging och elektronmikroskopi representerar är ett mycket kraftfullt medel för att undersöka de dyna…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma till Fondazione Filarete för dess hjälp och stöd i publiceringen av denna artikel. Vi vill också tacka Centro Europeo di Nanomedicina för användning av Tecnai G2 transmissionselektronmikroskop.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehyde Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Science | 19150 | |
| Uranyl Acetate dihydrate | Sigma Aldrich | 73943 | slightly radioactive |
| Propylene Oxide | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON embedding medium kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Lead Citrate | Electron Microscopy Science | 17800 | |
| Bench top centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Microscope Cage Incubation System | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| steel culture cell chamber for 24 mm coverslip | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Electron Microscopy grids | Electron Microscopy Science | G300Cu |
References
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).
- Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).
- Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and. 20, 87-123 (2004).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).
- Papiani, G., et al. Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome. J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).
- Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization. J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).
- Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. The dynamic ER: experimental approaches and current questions. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).
- Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 12, 327-342 (1994).
- Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital. Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).
- Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells. J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13, 643-649 (2012).
- Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres. J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
- Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. EMBO J. 27, 336-349 (2008).
- Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways. Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
- Michida, T., et al. Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).
