सभ्य कोशिकाओं में जालिका उप के दृश्य
Summary
हम हम जीवित कोशिकाओं की confocal इमेजिंग के माध्यम से जालिका (ईआर) में निवासी ट्रांसफ़ेक्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन के वितरण और गतिशीलता की जांच करने के लिए उपयोग इमेजिंग तरीकों का वर्णन. हम भी ultrastructurally इस subcellular डिब्बे की वास्तुकला पर उनकी अभिव्यक्ति के प्रभाव का विश्लेषण.
Abstract
इन तीव्र interorganelle आणविक यातायात के बावजूद उनकी विशिष्ट संरचना और कार्यों को बनाए रखने हालांकि कोशिकाओं में लिपिड और प्रोटीन लगातार सेल के डिब्बों के बीच विमर्श कर रहे हैं. इस पत्र में वर्णित तकनीक vivo में और उनके मनोवैज्ञानिक वातावरण में प्रोटीन और लिपिड गतिशीलता और तस्करी का अध्ययन कर के शक्तिशाली साधन हैं. (फ्लिप) photobleaching में (FRAP) और प्रतिदीप्ति नुकसान photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली व्यापक रूप Exo-endocytic मार्ग, organelles या subcompartments के बीच निरंतरता, प्रोटीन परिसरों के गठन, और प्रोटीन स्थानीयकरण के माध्यम से intracellular तस्करी के अध्ययन के लिए जीना सेल इमेजिंग तकनीक का इस्तेमाल कर रहे हैं लिपिड microdomains में, जो सभी के लिए शारीरिक और रोग परिस्थितियों में देखा जा सकता है. इन तरीकों की सीमाओं के कारण फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन का उपयोग करने के लिए मुख्य रूप से कर रहे हैं, और उनके संभावित कमियां अधिक व्यक्त artifactual शामिलकोशिकाओं में आयन और टैग और देशी प्रोटीन की तह और स्थानीयकरण में मतभेद की संभावना. अंत में, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी (लगभग 200 एनएम) के संकल्प की सीमा के रूप में तनाव के तहत कोशिकाओं में पैदा कर सकते हैं कि ईआर या विशिष्ट subcompartments के ठीक संरचना की जांच की अनुमति नहीं है (यानी हाइपोक्सिया, औषधि प्रशासन, transmembrane की अभिव्यक्ति से अधिक ईआर निवासी प्रोटीन) या रोग की स्थिति के तहत, हम ultrastructural साथ सुसंस्कृत ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के रहने कक्ष इमेजिंग गठबंधन ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पर आधारित विश्लेषण करती है.
Introduction
हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और उसके वर्णक्रम वेरिएंट, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का समानांतर विकास की खोज, कोशिकाओं में प्रोटीन व्यवहार की जांच के लिए पूरी तरह से नए रास्ते खोल दिया है. क्योंकि तीव्र रोशनी के तहत उनके प्रतिदीप्ति बुझाने fluorophores की आंतरिक क्षमता के संभव हैं जो (फ्लिप), photobleaching में (FRAP) और प्रतिदीप्ति नुकसान photobleaching के बाद इस तरह के प्रतिदीप्ति वसूली के रूप में तकनीक, confocal जीना सेल इमेजिंग के आधार पर कर रहे हैं और का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन 1-3. उन्होंने व्यापक रूप से उनके कार्य 4 के विषय में महत्वपूर्ण सुराग प्रकट कर सकते हैं, जो प्रोटीन का स्थानीयकरण, लेकिन यह भी अपनी गतिशीलता और vesicular परिवहन, न केवल आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं.
कोशिकाओं की अनूठी विशेषता विशिष्ट लिपिड और प्रोटीन रचनाओं है कि intracellular डिब्बों की उपस्थिति है. Organelles शारीरिक रूप से ISOLAT यद्यपिएड, वे एक दूसरे के साथ संवाद करने और सेलुलर homeostasis को बनाए रखने के क्रम में आणविक घटकों को साझा करने की आवश्यकता है. स्रावी मार्ग ईआर में संश्लेषित प्रोटीन और लिपिड वे उनके कार्य डालती है, जिसमें सही अंतिम गंतव्य तक पहुँचने कि गारंटी देता है. Intracellular organelles भी अणु (लिपिड) सीधे डिब्बों के बीच विमर्श किया जा करने की अनुमति है कि गतिशील संपर्क साइटों से जोड़ा जा सकता है. इसके अलावा, कई प्रोटीन को बड़े heteromeric परिसरों में इकट्ठे या कार्यात्मक रूप से सक्रिय हो या उनके अंतिम गंतव्य के लिए ले जाया जा क्रम में विशिष्ट लिपिड प्रजातियों (लिपिड rafts / microdomains) के साथ जुड़े है. इन जैविक पहलुओं के सभी बहुत प्रोटीन की गतिज गुणों को प्रभावित है, और इसलिए उचित नीचे वर्णित तकनीकों के माध्यम से जांच की जा सकती है.
हमारे समूह ईआर की वास्तुकला और इसकी विभिन्न उप अध्ययन करने के क्रम में व्यापक रूप से FRAP इस्तेमाल किया गया है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त फ्लिपडोमेन. ईआर स्रावी मार्ग का पहला स्टेशन है और प्रोटीन और 5 छँटाई लिपिड में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. यह किसका अलग उप डोमेन उसके कई विभिन्न कार्यों (यानी प्रोटीन और लिपिड जैवसंश्लेषण और तस्करी, प्रोटीन तह, 2 Ca + भंडारण और जारी है, और जीनोबायोटिक चयापचय) को प्रतिबिंबित एक अत्यधिक गतिशील organelle है. वे स्थानिक, आकृति विज्ञान के हैं, और कार्यात्मक अलग हालांकि, हालांकि, इन डोमेन एक दूसरे के साथ लगातार कर रहे हैं, और उनके रिश्तेदार बहुतायत शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत कोशिकाओं में संशोधित किया जा सकता है. सबसे अच्छा ज्ञात और ईआर की आमतौर पर स्थानिक अलग डोमेन परमाणु लिफाफा, और चिकनी और किसी न किसी एर रहे हैं, लेकिन, हम और दूसरों ईआर संरचनाओं विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में एक अधिक विस्तृत वास्तुकला और तीन आयामी संगठन के साथ कर रहे हैं कि प्रदर्शन किया और है भी ऐसी हाइपोक्सिया, दवा के रूप में तनावपूर्ण उत्तेजनाओं के माध्यम से प्रेरित किया जा सकता है कि शारीरिक शर्तों के अधीन ऊतकोंप्रशासन, या ईआर निवासी transmembrane प्रोटीन 2,6 की अभिव्यक्ति से अधिक (और उसमें संदर्भ).
हम भी हाल ही में मानव रोगों 1,7 की सेल मॉडल में ऐसी संरचनाओं की उपस्थिति का प्रदर्शन किया है. चिकनी ईआर की खड़ी cisternae से होने वाले वे भी उनके वास्तुकला के आधार पर karmellae, lamellae, और स्फटिकवत् ईआर के रूप में जाना जाता है, वे 2003 6 में संगठित चिकनी जालिका (OSER) का सामूहिक नाम दिया गया है, जो की तरह अपने का आकार, भिन्न हो सकते हैं. कोशिकाओं पूंछ लंगर (टीए) ईआर निवासी प्रोटीन (डी EGFP-ईआर), ट्रांस में GFP के कमजोर dimerizing प्रवृत्ति नाटकीय रूप से ईआर के संगठन और संरचना बदल के साइटोसोलिक क्षेत्र से जुड़े हुए GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं. FRAP और फ्लिप प्रयोगों डी EGFP-ईआर OSERs भीतर फैलाना करने के लिए स्वतंत्र है कि पता चला है, और यह OSER को जालीदार ईआर से चलता रहता है और ठीक इसके विपरीत <तथ्य यह है कि/ उन्हें> समुच्चय आसपास के जालीदार ईआर के साथ लगातार कर रहे हैं कि इंगित करता है. Ultrastructural विश्लेषण हमें nanoscale स्तर पर OSER वास्तुकला और संगठन की एक विस्तृत विवरण के साथ प्रतिदीप्ति डेटा सहसंबंधी करने की अनुमति दी: OSERs हमेशा चिकनी ईआर की बनती cisternae के ढेर से बना रहे हैं, लेकिन इस तरह के नियमित sinusoidal की व्यवस्था के रूप में स्थानिक संगठन के विभिन्न रूपों, हो सकता है सरणियों या whorls, या हेक्सागोनल "बिल्लौर की तरह" ट्यूबलर सरणियों. इन rearrangements वे शारीरिक स्थितियों 9 और ऐसे हाइपोक्सिया 10, दवा उपचार 11, और कैंसर 9 के रूप में निम्नलिखित तनावों के तहत कोशिकाओं में पाया गया है, के रूप में ultrastructural मार्कर के रूप में महत्वपूर्ण क्षमता हो सकती है, जो घन morphologies 8 को जन्म दे.
GFP संलयन प्रोटीन का उपयोग इस पहले प्रदर्शन के बाद, हम औषधीय उपचार 12, asse के जवाब में ईआर डोमेन के प्रसार का विश्लेषण करने के लिए इमेजिंग प्रयोगों में इस्तेमाल कियाएसएस कोशिकाओं 13 में oligomerise के लिए, और उसके pathogenicity 1,8 के लिए प्रासंगिक हो सकता है कि ईआर मूल के intracellular समुच्चय के गठन में एक उत्परिवर्ती, ए एल एस से जुड़े टीए प्रोटीन की भूमिका की जांच करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रवृत्ति. यह (कई neurodegenerative रोगों 14 में होता है) intracellular समुच्चय के गठन विषाक्त उत्परिवर्ती प्रोटीन और आसपास सेल घटकों 15 के बीच बातचीत को रोकने के लिए बनाया गया एक सुरक्षा तंत्र है, हो सकता है कि सुझाव दिया गया है.
इसके बाद जिसका सी टर्मिनल हाइड्रोफोबिक डोमेन ईआर की झिल्ली में डाला जाता है, और उनके गतिशील व्यवहार के विश्लेषण और ईआर डोमेन पर उनकी अभिव्यक्ति के प्रभाव निर्माणों की जांच के लिए ऑप्टिकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तरीकों का एक संयोजन का वर्णन है सभ्य कोशिकाओं में वास्तुकला (प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की एक प्रवाह संचित्र के लिए चित्रा 1 देखें).
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल और इमेजिंग दृष्टिकोण जीवित कोशिकाओं के ईआर में निवासी ट्रांसफ़ेक्ट टीए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का वितरण और गतिशीलता की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है. हम भी ultrastructural विश्लेषण ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस लेख के प्रकाशन में अपनी सहायता और समर्थन के लिए Fondazione Filarete के लिए आभारी हैं. हम भी Tecnai G2 संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल के लिए सेंट्रो Europeo di Nanomedicina धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehyde Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Science | 19150 | |
| Uranyl Acetate dihydrate | Sigma Aldrich | 73943 | slightly radioactive |
| Propylene Oxide | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON embedding medium kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Lead Citrate | Electron Microscopy Science | 17800 | |
| Bench top centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Microscope Cage Incubation System | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| steel culture cell chamber for 24 mm coverslip | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Electron Microscopy grids | Electron Microscopy Science | G300Cu |
References
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