배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화
Summary
우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.
Abstract
이러한 강렬한 interorganelle 분자 트래픽에도 불구하고 자신의 독특한 구성과 기능을 유지하지만 진핵 세포의 지질과 단백질은 지속적으로, 세포 구획 사이에 교환됩니다. 이 문서에 설명 된 기술은 생체 내에서 자신의 생리적 환경에서 단백질과 지질의 이동성과 인신 매매를 공부하는 강력한 수단입니다. (FLIP)을 photobleaching에에 (FRAP) 및 형광 손실을 photobleaching에 후 형광 복구 널리 엑소-세포 내 이입 통로, 세포 기관 또는 subcompartments 사이의 연속성, 단백질 복합체의 형성, 단백질 지역화보기를 통해 세포 내 인신 매매를 공부 라이브 세포 이미징 기술을 사용하는 지질 마이크로 도메인에서 모두의 생리적 및 병리 적 조건에서 관찰 될 수있다. 이러한 방법의 한계로 인해 형광 융합 단백질의 용도에 주로, 그들의 잠재적 인 단점 과발현 인공적 포함세포에서 이온과 태그 및 기본 단백질의 접힘 및 현지화의 차이의 가능성. 마지막으로, 광학 현미경 (약 200nm)의 해상도의 한계로 스트레스 세포에서 유래 할 수있는 ER 또는 특정 subcompartments의 미세 구조의 조사를 허용하지 않는 (즉, 저산소증, 약물 투여, 횡단의 과발현 ER 상주 단백질) 또는 병적 인 조건에서, 우리는 미세 배양 형질 세포의 라이브 세포 이미징을 결합하여 투과 전자 현미경을 기준으로 분석한다.
Introduction
녹색 형광 단백질 (GFP) 및 스펙트럼 변형, 형광 현미경의 평행 개발의 발견은 세포에있는 단백질 행동의 조사를 위해 완전히 새로운 길을 열었습니다. 때문에 강렬한 조명 아래에서 자신의 형광을 소화하는 형광 물질의 고유 용량이 가능하다 (FLIP)을 photobleaching에에 (FRAP) 및 형광 손실을 photobleaching에 후 같은 형광 복구와 같은 기술은, 공 초점 라이브 세포 이미징을 기반으로하고의 사용은 형질 형광 융합 단백질 1-3. 그들은 널리 자신의 기능 4와 관련된 중요한 단서를 공개 할 수있는 단백질의 현지화뿐만 아니라, 자신의 이동성과 기공을 갖는 전송뿐만 아니라,을 평가하는 데 사용됩니다.
진핵 세포의 고유 기능은 특정 지질과 단백질 성분이 세포 내 구획의 존재입니다. 세포 소기관은 물리적으로 isolat와 있지만ED는 그들이 서로 통신 및 셀룰러 항상성을 유지하기 위해 분자 구성 요소를 공유 할 필요가있다. 분비 경로는 ER에서 합성 단백질과 지질이 그들의 기능을 발휘하는 정확한 최종 목적지에 도달 할 수 있음을 보장합니다. 세포 내 소기관 또한 분자 (지질)에 직접 구획 사이에서 교환 될 수 있도록 동적 접촉 위치에 의해 접속 될 수있다. 또한, 많은 단백질에 큰 이종 체 단지에서 조립 또는 기능적으로 활성화 될 수 또는 최종 목적지로 이송하기 위해 특정 지질 종 (지질 뗏목 / 마이크로 도메인)와 관련있다. 이러한 생물학적 측면 모두는 크게 단백질의 역학적 특성에 영향을 미치는, 따라서 적절하게 아래에 설명 된 기술에 의해 조사 할 수있다.
우리 그룹은 ER의 아키텍처와 다른 서브를 연구하기 위해 널리 FRAP를 사용하고 전자 현미경과 결합 플립도메인. ER은 분비 경로의 제 1 국이고, 단백질과 지질 5 선별에 중요한 역할을한다. 그것은 누구의 고유 한 하위 도메인의 여러 가지 기능 (예 : 단백질과 지질의 생합성 및 인신 매매, 단백질 폴딩, 칼슘 2 + 저장 및 해제, 및 생체 이물 대사)를 반영하는 매우 역동적 인 세포 기관이다. 그들이 공간적, 형태 학적, 그리고 기능적으로 구별 그러나, 비록 이러한 도메인은 서로 연속하고, 그들의 상대적인 풍부함 생리 및 병리 적 조건하에 세포에서 변형 될 수있다. 가장 잘 알려진 및 ER의 보통 공간적으로 분리 된 도메인들은 핵막 및 매끄럽고 거친 ER이며 그러나 다른 사람은 ER 구조는 다양한 종류의 세포에서보다 정교한 구조 및 3 차원 조직이 있다는 것을 증명하고있다 또한 저산소증, 약물과 같은 스트레스 자극에 의해 유도 될 수있는 생리 학적 조건 하에서 조직관리, 또는 ER 상주 횡단 단백질 2,6의 과발현 (및 참조 안에).
우리는 또한 최근에 인간의 질병 1,7의 세포 모델에서 이러한 구조의 존재를 증명하고있다. 부드러운 ER의 누적 cisternae에서 발생 그들은 또한 그들의 아키텍처에 기초 karmellae, 얇은 판자, 및 결정상 ER로 알려져 있지만, 그들은 2003 년 6 조직 부드러운 소포체 (OSER)의 집단 이름이 부여 된, 같은 자신 크기는 다를 수 있습니다. 세포는 꼬리 고정 (TA) ER 상주 단백질 (D의 EGFP-ER), 트랜스에서 GFP의 약한 이합체 경향이 극적으로 ER의 조직과 구조를 변경의 세포질 영역에 융합 GFP 형질 전환 된 후. FRAP 및 플립 실험은 D EGFP-ER은 OSERs 내에서 확산 자유롭게 것으로 나타났다하고 OSER에 망상 ER에서 이동하고 그 반대의 경우도 마찬가지 <사실/ 엠> 집계 주변의 망상 ER 연속 있음을 나타냅니다. 미세 분석은 우리가 나노 수준에서 OSER 아키텍처와 조직에 대한 자세한 설명과 함께 형광 데이터의 상관 관계를 할 수있다 : OSERs은 항상 부드러운 ER의 쌍 cisternae의 스택으로 구성되어 있지만, 이러한 정기적 사인 배치로 공간 조직의 다양한 형태를 가질 수 배열이나 윤 생체, 또는 육각형의 "결정체"관의 배열. 이러한 재 배열들은 생리적 조건 9 저산소증 10, 약물 치료 11 암 9로 다음과 같은 스트레스에 따라 세포에서 발견 된 것처럼, 미세 마커 상당한 잠재력을 가지고있다, 입방 형태학 8로 이어집니다.
GFP 융합 단백질을 사용하여이 제 데모 후에, 우리는 약물 치료 12 ASSE에 응답하여 ER 도메인의 증식을 분석하기 위해 이미징 실험을 사용SS 세포 13 oligomerise하고, 그 병원성 1,8 관련된 수도 ER 계 세포 응집체의 형성에 돌연변이, ALS TA-결합 단백질의 역할을 조사하기 위해 형광 단백질의 경향. 그것은 (많은 신경 변성 질환 (14)에서 발생하는) 세포 응집체의 형성이 독성 돌연변이 단백질 및 주변 셀 요소 (15) 사이의 상호 작용을 방지하기위한 보호 메커니즘이 될 수 있다는 것을 제안하고있다.
다음은 그의 C-말단 소수성 도메인은 ER의 세포막 내로 삽입되고, 자신의 동적 거동의 분석 및 ER 도메인에서 자신의 과발현의 효과 구조를 조사하는 광학 및 전자 현미경 방법의 조합에 대하여 설명한다 배양 된 세포의 구조 (실험 프로토콜의 흐름도는 그림 1 참조).
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에 설명 된 프로토콜 및 이미징 방법은 살아있는 세포의 ER에 거주 형질 TA 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용되었다. 우리는 또한 미세 구조 분석에 의해이 세포 내 구획의 구조에서 이러한 단백질의 과발현의 효과를 분석 하였다.
살아있는 세포 공 촛점 이미징 및 전자 현미경의 조합이 단백질의 동적 특성을 조사의 매우 강력한 수단이다 나타내고, 단백…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 문서의 게시에있는 그것의 도움과 지원을위한 폰다 치오 Filarete에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 TECNAI G2 투과 전자 현미경의 사용 센트로 피오 디 Nanomedicina에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehyde Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Science | 19150 | |
| Uranyl Acetate dihydrate | Sigma Aldrich | 73943 | slightly radioactive |
| Propylene Oxide | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON embedding medium kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Lead Citrate | Electron Microscopy Science | 17800 | |
| Bench top centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Microscope Cage Incubation System | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| steel culture cell chamber for 24 mm coverslip | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Electron Microscopy grids | Electron Microscopy Science | G300Cu |
References
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).
- Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).
- Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and. 20, 87-123 (2004).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).
- Papiani, G., et al. Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome. J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).
- Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization. J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).
- Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. The dynamic ER: experimental approaches and current questions. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).
- Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 12, 327-342 (1994).
- Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital. Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).
- Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells. J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13, 643-649 (2012).
- Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres. J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
- Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. EMBO J. 27, 336-349 (2008).
- Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways. Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
- Michida, T., et al. Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).
