Визуализация эндоплазматической сети субдоменов в культивируемых клетках
Summary
Описаны подходы изображений мы используем, чтобы исследовать распределение и мобильность трансфектированных флуоресцентных белков резидентов в эндоплазматической сети (ER) с помощью конфокальной микроскопии живых клеток. Мы также ультраструктурно проанализировать влияние их экспрессии на архитектуру этого субклеточной отсека.
Abstract
Липиды и белки в клетках эукариот постоянно обмениваются клеточных отсеках, хотя они сохраняют свою особую состав и функции, несмотря на интенсивный interorganelle молекулярной трафика. Методы, описанные в этой статье, являются мощным средством изучения белков и липидов мобильность и торговлей в естественных условиях и в их физиологической среде. Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) и потери флуоресценции в фотообесцвечивания (Flip) широко используются методы проживанию ячейки изображения для изучения внутриклеточных торговлей через экзо-эндоцитотический пути, локализация образование белковых комплексов, и белка непрерывность между органелл или субкомпартментов в липидных микродоменов, все из которых могут наблюдаться при физиологических и патологических состояний. Ограничения этих подходов в основном за счет использования флуоресцентного слитых белков, и их потенциальные недостатки включают артефактом над-экспрессионов в клетках и возможность различий в складывания и локализации меченых и нативных белков. Наконец, как предел разрешения оптической микроскопии (около 200 нм) не позволяет исследование тонкой структуры ER или конкретных субкомпартментов которые могут происходят в клетках в условиях стресса (то есть гипоксия, введение лекарственного средства, по-выражение трансмембранного белки ER-резидентов) или при патологических состояниях, мы объединяем живых клеток изображений культивируемых трансфекции клеток с Ультраструктурные анализирует на основе просвечивающей электронной микроскопии.
Introduction
Открытие зеленого флуоресцентного белка (GFP) и ее спектральных вариантов, и параллельного развития флуоресцентной микроскопии, открыли совершенно новые возможности для исследования поведения белка в клетках. Такие методы, как флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания (FRAP) и потери флуоресценции в фотообесцвечивания (Flip), которые являются возможным из-за внутренней емкости флуорофорами погасить их флуоресценции при интенсивном освещении, основаны на конфокальной микроскопии живых клеток и использование трансфецировали флуоресцентные белки слияния 1-3. Они широко используются для оценки не только локализацию белков, но и их мобильность и везикулярного транспорта, который может выявить важные подсказки, касающиеся их функции 4.
Уникальной особенностью эукариотических клеток является наличие внутриклеточных компартментах, имеющих определенные липидные и белковые композиции. Хотя органеллы физически изолированныйе изд, они должны взаимодействовать друг с другом и совместно молекулярные компоненты для поддержания клеточного гомеостаза. Секреторный путь гарантирует, что белки и липиды, синтезированные в ЭР достичь правильной конечного пункта назначения, в которых они осуществляют свои функции. Внутриклеточных органелл также может быть связано с тем, динамических контактных сайтов, которые позволяют молекулы (липиды), которые будут непосредственно обмениваются отсеков. Более того, многие белки в собранном в больших гетеромерных комплексов или связаны с конкретными видами липидных (липидного плоты / микродоменов), чтобы стать функционально активный или перевозиться к месту назначения. Все эти биологические аспекты значительно влиять на кинетические свойства белков, и поэтому может быть соответствующим образом исследованы с помощью методов, описанных ниже.
Наша группа широко используется FRAP и FLIP в сочетании с электронной микроскопии для изучения архитектуры ЭР и его различных субдомены. ER является первой станцией секреторного пути и играет ключевую роль в белков и липидов сортировки 5. Это очень динамичный органеллы которого отличается поддоменов отразить его много различных функций (то есть белков и липидов биосинтеза и торговлей людьми, белок складывающиеся, Са 2 + хранения и выпуска, и ксенобиотиков метаболизма). Однако, хотя они морфологически, пространственно и функционально различны, эти домены являются непрерывными друг с другом, и их относительное содержание может быть изменено в клетках при физиологических и патологических состояний. Самый известный и обычно пространственно разделенные домены ER являются ядерная оболочка, а гладкая и грубая ER, однако, мы и другие показали, что есть ER структуры с более сложной архитектурой и трехмерной организации в различных типах клеток и тканей в физиологических условиях, которые также могут быть вызваны с помощью стрессовые стимулы, такие как гипоксия, препаратавведения или более-выражение ER-резидентом трансмембранных белков 2,6 (и ссылки в ней).
Мы также недавно продемонстрировали наличие таких структур в клеточных моделей заболеваний человека 1,7. Возникнув от уложенных цистерн гладкого ЭР, им дали коллективное имя организованной гладкой эндоплазматической сети (Осер) в 2003 году 6, хотя они также известны как karmellae, ламелями, и кристаллоидным ER на основе их архитектуры, которая, как и их размер, может варьироваться. После того как клетки трансфицируют GFP, слитый с цитозольной области хвост-якорь (ТП) ER-резидентом белки (г EGFP-ER), слабо димеризации тенденция GFP в транс резко изменяет организацию и структуру ЭР. FRAP и FLIP эксперименты показали, что г EGFP-ER может свободно диффундировать в OSERs, и тот факт, что она движется от ретикулярной ER к Осер и наоборот </ EM> указывает, что агрегаты непрерывного с окружающей ретикулярной ER. Ультраструктурный анализ позволил нам сопоставить данные флуоресценции с подробным описанием Осер архитектуры и организации на наноуровне: Бюро входят всегда состоят из стопок в паре цистерн гладкого ЭР, но может иметь различные формы пространственной организации, такие, как регулярно устраиваются синусоидальной массивы или оборотов, или шестиугольные "кристаллоидные" трубчатые массивы. Эти перестройки приводят к кубических морфологии 8, которые, как они были найдены в клетках в физиологических условиях 9 и следующих напряжений, таких как гипоксия 10, медикаментозного лечения 11 и рак 9, могут иметь значительный потенциал в качестве ультраструктурных маркеров.
После этого первого демонстрации с использованием гибридных белков GFP, мы использовали эксперименты изображений для анализа распространения ER доменов в ответ на фармакологического лечения 12, Ассесс тенденция флуоресцентных белков в oligomerise в клетках 13, а также расследовать роль мутанта, ALS-связанного белка ТА в формировании внутриклеточных агрегатов ER происхождения, которые могут иметь отношение к его патогенности 1,8. Было высказано предположение, что формирование внутриклеточных агрегатов (что имеет место во многих нейродегенеративных заболеваний 14) может быть защитный механизм, предназначенный для предотвращения взаимодействия между токсичных мутантных белков и окружающих компонентов клетки 15.
Далее следует описание комбинации оптических и электронных методов микроскопии для исследования конструкций, чей С-концевой гидрофобные домены вставляются в мембрану ЭР, а также анализ их динамического поведения и последствий их чрезмерной экспрессии на домене ER архитектура в культивируемых клетках (см. рисунок 1 для блок-схему экспериментального протокола).
Protocol
Representative Results
Discussion
Протоколы и подходы визуализации, описанные в этой статье, были использованы для исследования распределения и мобильности трансфектированных TA флуоресцентных белков резидентов в ЭР живых клеток. Мы также проанализировали влияние над экспрессия этих белков на архитектуре этой субкл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны Fondazione Филарете за его помощь и поддержку в публикации этой статьи. Мы также хотели бы поблагодарить Centro Europeo ди Nanomedicina для использования Tecnai G2 просвечивающего электронного микроскопа.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehyde Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Science | 19150 | |
| Uranyl Acetate dihydrate | Sigma Aldrich | 73943 | slightly radioactive |
| Propylene Oxide | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON embedding medium kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Lead Citrate | Electron Microscopy Science | 17800 | |
| Bench top centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Microscope Cage Incubation System | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| steel culture cell chamber for 24 mm coverslip | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Electron Microscopy grids | Electron Microscopy Science | G300Cu |
References
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).
- Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).
- Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and. 20, 87-123 (2004).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).
- Papiani, G., et al. Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome. J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).
- Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization. J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).
- Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. The dynamic ER: experimental approaches and current questions. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).
- Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 12, 327-342 (1994).
- Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital. Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).
- Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells. J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13, 643-649 (2012).
- Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres. J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
- Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. EMBO J. 27, 336-349 (2008).
- Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways. Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
- Michida, T., et al. Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).
