Ретроградная Маркировка ганглиозных клеток сетчатки в взрослых данио рерио флуоресцентными красителями
Summary
We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.
Abstract
Как ретроградные маркировки ганглиозных клеток сетчатки (РГК) можно выделить РГК somata от смерти сайтов, он стал золотым стандартом для подсчета РГК в РСК выживания и экспериментов по регенерации. Многие исследования были проведены у млекопитающих животных для исследования РГК выживаемость после зрительного повреждения нерва. Тем не менее, ретроградная маркировка РГК в взрослых данио до сих пор не сообщили, хотя некоторые альтернативные методы могут рассчитывать числа клеток в слоях сетчатки клеток ганглиев (RGCL). Учитывая небольшой размер взрослого данио черепа и высоким риском смерти после бурения на черепе, мы открываем череп с помощью кислотно-травления и запечатать дыру с легким отверждения связи, которые могут существенно улучшить выживаемость. После поглощения красителей в течение 5 дней, почти все РГК помечены. Поскольку этот метод не нужно секут зрительный нерв, он незаменим в исследовании РСК выживания после зрительного давке нерва в взрослых данио. Здесь мы вводимэтот метод шаг за шагом и получения репрезентативных результатов.
Introduction
Как взрослый данио имеют сильную способность к регенерации аксонов после зрительного повреждения нерва 1, правильный метод для подсчета весь РГК важно оценить РГК выживания и регенерации 2. На основе методов ретроградных маркировки РГК в млекопитающих и золотая рыбка 3 – 5, мы построили метод маркировать РГК из тектуме в взрослых данио. Для взрослых данио, две критические технические проблемы Следует отметить: череп взрослых данио очень мала 6; они живут в водной среде. Здесь мы рассматриваем череп с травителя, который сводит к минимуму опасности, связанные с бурением 5. Затем мы запечатать дыру с легким отверждения связи, который улучшает выживаемость животных после операции.
Ранее несколько другие методы были приняты для подсчета количества РГК косвенным образом. Его окрашивания в секциях сетчатки этикетки всех видов клеток в RGCL 7. Маркировка антитела в целом гЭтина, таких как островок-1, также могут маркировать амакринных клетки 8. Хотя ретроградный этикетка от зрительного нерва культи может обозначить все РГК в сетчатке, он не может быть принят в модели на раздавливание, поскольку он вызывает дополнительное повреждение зрительного нерва. Воспользовавшись ретроградной этикетке от тектуме, мы исследовали РГК выживания и регенерации в зрительного нерва давки. Результаты показывают, что почти все РГК выжил и более 90% РГК регенерируется в тектуме в первую неделю в краш-модели 9.
Для того чтобы успешно обозначить все РГК, DiI паста была выбрана после сравнения с несколькими другими коммерческими красителей 10. Во-первых, оно специально разработано для в естественных тканей маркировки. Во-вторых, это липофильный краситель, который не может диффундировать в воду. Кроме того, эта флуоресценция может сохраняться в течение длительного времени, что делает его отличным кандидатом для исследования выживаемости РСК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retrograde маркировка РСК важно, чтобы исследования РСК выживаемость у млекопитающих, но это не был использован в данио рерио. Альтернативные методы, ОН окрашивания 7 и окрашивание антител 8, не золотые стандарты для подсчета количества ГКС, и трансгенных линий со всеми РСК мечен?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the ‘Hundred Talents Project’ of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).
Materials
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521 | USA |
| DiI | Invitrogen | N22880 | USA |
| lightcuring bond | Heraeus Kulzer | Durafill bond | Germany |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer | Gluma Etch 35 Gel | Germany |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co. | Power Blue Light Curing Unit | China |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
