मात्रात्मक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी: सेलुलर की biophysical के मापन के लिए एक मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ सुविधाएँ
Summary
We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.
Abstract
हम उज्ज्वल क्षेत्र और अंतर हस्तक्षेप विपरीत कल्पना का एक संयोजन के माध्यम से बड़े पैमाने पर, मात्रा, और सेलुलर नमूनों पर घनत्व के मात्रात्मक माप प्रदर्शन करने के लिए एक मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के उपयोग का वर्णन. दो प्राथमिक दृष्टिकोण प्रस्तुत कर रहे हैं: noninterferometric मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपी (NIQPM), कुल सेल द्रव्यमान और subcellular घनत्व वितरण के माप प्रदर्शन करने के लिए, और हिल्बर्ट मात्रा निर्धारित करने के लिए अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (HTDIC) बदलना. कम संख्यात्मक एपर्चर (एनए) रोशनी, कमजोर बिखरने, और नमूना द्वारा प्रकाश की कमजोर अवशोषण: NIQPM लहर प्रसार का एक सरल मॉडल पर आधारित है, तीन अंतर्निहित मान्यताओं के साथ, paraxial सन्निकटन करार दिया. सौभाग्य से, बेदाग सेलुलर नमूनों इन मान्यताओं को संतुष्ट और कम NA रोशनी आसानी से वाणिज्यिक सूक्ष्मदर्शी पर हासिल की है. HTDIC उच्च एनए illumin तहत के माध्यम से फोकस डीआईसी कल्पना से बड़ा जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता हैव्यावहारिक स्थितियों. उच्च एनए रोशनी ऑप्टिकल अक्ष के साथ नमूना की बढ़ी सेक्शनिंग सक्षम बनाता है. हिल्बर्ट डीआईसी छवि पर प्रोसेसिंग बदलना बहुत ढेर पृष्ठभूमि के उन लोगों से नमूना तीव्रता के ग्रे मूल्यों को अलग करके तीन आयामों में नमूना सीमाओं का स्थानीयकरण के लिए बढ़त का पता लगाने एल्गोरिदम को बढ़ाता है. NIQPM और HTDIC का प्राथमिक लाभ "बंद-the-शेल्फ" माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अपने तकनीकी पहुँच में निहित है. वाणिज्यिक scopes पर धीमी z ढेर अधिग्रहण के समय वर्तमान में तेजी से 1 फ्रेम / मिनट से भी घटना की जांच abrogates, और दूसरी बात, विवर्तन प्रभाव 10 से ऊपर 0.2 से वस्तुओं को NIQPM और HTDIC की उपयोगिता को प्रतिबंधित: इन तरीकों में से दो बुनियादी सीमाएं हैं क्रमशः (NIQPM) और व्यास में 20 (HTDIC) माइक्रोन,. इसलिए, ब्याज का नमूना और उसके संबंधित समय गतिशीलता इन तरीकों के उपयोग को सक्षम करने के लिए निश्चित आकार और अस्थायी कमी को पूरा करना होगा. Excitingly, सबसे तय सूक्ष्मकोशिकाआर नमूनों आसानी से इन तरीकों के साथ जांच कर रहे हैं.
Introduction
ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग अब सेलुलर जीव की जांच में सर्वव्यापी है. कारण दिखाई ऑप्टिकल स्पेक्ट्रम पर उनके कम अंतर्जात absorbance और कमजोर बिखरने गुण के लिए, कोशिकाओं दृढ़ता से उन्हें गुजर ऑप्टिकल तरंगों के आयाम को प्रभावित करते हैं और इस प्रकार मानक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ imaged जब अर्द्धपारदर्शी नहीं दिखाई देते. सेलुलर नमूनों, तथापि, रैखिक प्रकाश, जिसमें यात्रा के माध्यम से अंतरिक्ष की एक विशेष क्षेत्र में स्थानीय जन घनत्व की राशि से संबंधित है जो उन्हें एक तरह के माध्यम से यात्रा ऑप्टिकल तरंगों को धीमा है. इस विषम समय अंतराल या सूक्ष्म नमूनों के माध्यम से प्रेषित ऑप्टिकल लहरों की "चरण" प्रोफाइल की उपयोगिता पहले Frits Zernike 1 द्वारा 1935 में वर्णित है और प्रयोगात्मक Zernikein 1942 2 द्वारा महसूस किया गया. Zernike इस उपलब्धि के लिए 1953 में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया. जीस 1945 3 में इस साधन का वाणिज्यीकरण किया. 1955 में, स्मिथ और Nomarskमैं अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी, एक विपरीत तंत्र के रूप में चरण के स्थानिक ढाल का उपयोग करता है कि एक साधन के उपयोग के 4 और सिद्धांत 5 पर उनकी प्रारंभिक काम प्रस्तुत करेंगे. डीआईसी Nomarski 6 साथ 1965in निकट सहयोग में Zeiss द्वारा commercialized था. 1981 में, दो प्रयोगशालाओं डीआईसी खुर्दबीन 7, 8 के प्रकाशिकी ट्रेन में वीडियो कैमरों के समावेश के साथ पहले रिकॉर्ड किया गया लाइव सेल डीआईसी कल्पना का प्रदर्शन किया. लाइव सेल इमेजिंग के युग का जन्म हुआ.
इस समय के बाद, वाणिज्यिक सूक्ष्मदर्शी पर चरण विपरीत और डीआईसी दोनों का निष्पादन बड़े पैमाने पर अपरिवर्तित रही है. आकृति विज्ञान, subcellular संरचनाओं की ट्रैकिंग, और झिल्ली गतिशीलता 9 की जांच की निगरानी: इन विधियों मुख्य गुणात्मक प्रयोजनों के लिए कोशिकाओं की छवियों का उत्पादन करने के लिए जीव के द्वारा उपयोग किया जाता है. इन तकनीकों में चरण और डि दोनों के रूप में उनकी "बंद-the-शेल्फ" विन्यास में गुणात्मक हैंसी छवियों मनमाना प्रकाश स्रोत तीव्रता का काम करता है, रोशनी प्रकाशिकी सेटिंग्स, और सीसीडी कैमरा लाभ, गामा, और प्रदर्शन सेटिंग्स हैं.
भौतिकविदों और ऑप्टिकल इंजीनियरों की एक छोटी सेना वाणिज्यिक इमेजिंग रूपात्मकता मात्रात्मक बनाने का प्रयास किया है. पहला प्रयासों के अलावा चिकित्सक बने जीवभौतिकीवेत्ता रॉबर्ट बार्स एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चरण माइक्रोस्कोप का उपयोग इन प्रकार की कोशिकाओं के माध्यम से चरण बदलाव का आकलन करके कोशिकाओं के सेलुलर शुष्क जन निर्धारित करने के लिए चरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रदर्शन किया जिसमें 1952 और 1953 में प्रकृति को दो पत्र थे 10, 11. चरण माइक्रोस्कोपी 10,11, डीआईसी माइक्रोस्कोपी 12-17, और ऑप्टिकल पथ लंबाई, चरण, जन निर्धारित करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र 18-22: क्षेत्र के तीन बुनियादी लेबल से मुक्त विपरीत तंत्र के आसपास आधारित आगामी वर्षों में तकनीक की एक भीड़ विकसित की है घनत्व, अपवर्तनांक, और सेलुलर मात्रा.
पैरा मेंllel, कस्टम ऑप्टिकल उपकरणों का एक बड़ा संग्रह भी 1950 के दशक के बाद से विकसित किया गया है, और परजीवी वृद्धि 23 आवेदन पत्र में से, लाल रक्त कोशिकाओं को 25 साल की झिल्ली गतिशीलता की जांच करने के लिए सेल चक्र 24 दस्तावेजीकरण को लेकर ऑप्टिकल माप दूरगामी बना दिया है. विशेष रूप से, पिछले दस वर्षों विवर्तन चरण माइक्रोस्कोपी 26 के फार्म, tomographic चरण माइक्रोस्कोपी 27, डिजिटल holographic माइक्रोस्कोपी 28, चरण संवेदनशील ऑप्टिकल जुटना माइक्रोस्कोपी 29, स्थानिक प्रकाश हस्तक्षेप माइक्रोस्कोपी 30, हिल्बर्ट में लेबल से मुक्त मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी का खजाना देखा गया है चरण माइक्रोस्कोपी 31, और मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपी 32. उनके सामूहिक सफलताओं के बावजूद, इन उपकरणों को अपने जटिल इंस्ट्रूमेंटेशन और कम्प्यूटेशनल जरूरतों के लिए, ज्यादातर के कारण जैविक शोधकर्ताओं के बड़े क्षेत्र को प्रचारित नहीं किया गया है.
इस के साथ साथ हम घउज्ज्वल क्षेत्र और डीआईसी कल्पना का एक संयोजन के माध्यम से बड़े पैमाने पर, मात्रा, और सेलुलर नमूनों पर घनत्व के मात्रात्मक माप प्रदर्शन करने के लिए एक मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग खींचाना. दो प्राथमिक दृष्टिकोण प्रस्तुत कर रहे हैं: noninterferometric मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपी (NIQPM), कुल सेल द्रव्यमान और subcellular घनत्व वितरण के माप प्रदर्शन करने के लिए, और हिल्बर्ट मात्रा निर्धारित करने के लिए, अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (HTDIC) बदलना. NIQPM और HTDIC का प्राथमिक लाभ उनके तकनीकी पहुँच में निहित है. उनके सफल क्रियान्वयन के लिए आवश्यक इमेजिंग की स्थिति सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूक्ष्मदर्शी की सामान्य ऑपरेशन के दायरे के भीतर हैं. साथ ही, बाद के प्रसंस्करण एल्गोरिदम, स्थिर, जल्दी, और मजबूत कर रहे हैं – जब भी संभव तेजी से फूरियर (FFT) आधारित एल्गोरिदम को बदलने का उपयोग कर MATLAB में लागू किया गया है.
NIQPM चरण और सीईएल के अक्षीय रूप से एकीकृत जन घनत्व के पुनर्निर्माण के लिए एक विधि हैउज्ज्वल क्षेत्र कल्पना से lular नमूनों. नमूना के क्षेत्र पर इस अक्षीय रूप से एकीकृत जन घनत्व के संकलन नमूना की कुल शुष्क जन सामग्री देता है. यह एक सेल के चरण प्रोफाइल नमूना के माध्यम से फोकस उज्ज्वल क्षेत्र कल्पना से खंगाला जा सकता है कि प्रदर्शन किया गया, जिसमें – – NIQPM प्रोटोकॉल Paganin और Nugent 18, 19 से रखी प्रयोगात्मक नींव पर आधारित है और फ्रैंक की सैद्धांतिक काम , Altmeyer, और वेर्निक 20 – एक कुशल FFT आधारित ढंग से paraxial लहर मॉडल को सुलझाने पर. शुष्क जन घनत्व चरण के कनेक्शन बार्स 10, 11 और पॉपेस्कु 33 से काम पर आधारित है.
बड़ा जानकारी ऑप्टिकल अक्ष के साथ नमूना के ऑप्टिकल सेक्शनिंग कि सक्षम उच्च एनए रोशनी परिस्थितियों में के माध्यम से फोकस डीआईसी कल्पना से प्राप्त किया जा सकता है. हिल्बर्ट डीआईसी छवि के ढेर पर प्रोसेसिंग बदलना बहुत बढ़ाता हैपृष्ठभूमि के उन लोगों से नमूना तीव्रता के ग्रे मूल्यों को अलग करके तीन आयामों में नमूना सीमाओं का स्थानीयकरण के लिए बढ़त का पता लगाने एल्गोरिदम. हम इसके विपरीत है और नमूना की स्वचालित बड़ा विश्लेषण के लिए एक सोबेल आधारित बढ़त का पता लगाने पद्धति को बढ़ाने के लिए दोनों फूरियर छानने के तरीकों को पेश किया है, हालांकि यह काम Arinson एट अल. 34 से निकलती है. हम भी विवर्तन सीमा से ऊपर व्यास 36 में 20 माइक्रोन के आकार में लेकर polystyrene क्षेत्रों पर पहले से HTDIC पुष्टि की है.
NIQPM और HTDIC दोनों वाणिज्यिक सूक्ष्मदर्शी पर उनके विकास के कारण तकनीकी रूप से सुलभ हैं, वहीं तरीकों मौलिक सूक्ष्मदर्शी स्वयं की हार्डवेयर विन्यास द्वारा सीमित हैं. इन तकनीकों के प्राथमिक सीमाओं दो गुना कर रहे हैं: के रूप में विरोध के कारण पूरे नमूना मंच का अनुवाद करने के लिए, वाणिज्यिक scopes पर धीमी z ढेर अधिग्रहण के समय बस उद्देश्य लेंस के लिएवर्तमान में तेजी से लगभग 1 फ्रेम / मिनट से भी घटना की जांच की सीमा, और दूसरी बात, विवर्तन प्रभाव क्रमशः, व्यास में 10 और 20 माइक्रोन अप करने के लिए 0.2 से आकार में लेकर वस्तुओं को NIQPM और HTDIC की उपयोगिता सीमित. इसलिए, ब्याज का नमूना और उसके संबंधित समय गतिशीलता ठेठ "बंद-the-शेल्फ" उपकरणों पर इन तरीकों के उपयोग को सक्षम करने के लिए निश्चित आकार और अस्थायी कमी को पूरा करना होगा. Excitingly, सबसे निश्चित सेलुलर नमूनों आसानी से इन तरीकों के साथ जांच कर रहे हैं.
NIQPM और HTDIC प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्र 1 में दिया जाता है. चित्रा 2 में हम उज्ज्वल क्षेत्र और डीआईसी कल्पना दोनों के लिए कम और उच्च दोनों NA रोशनी परिस्थितियों में इष्टतम और suboptimal के माध्यम से फोकस इमेजिंग वर्णन. 3 और 4 सफल और असफल implementations पर प्रकाश डाला NIQPM एल्गोरिथ्म के पैरामीटर निर्भरता का प्रदर्शन आंकड़े. <strong> चित्रा 5 HTDIC छवि प्रसंस्करण एल्गोरिथ्म में शामिल कदम दिखाता है और सेलुलर मात्रा निर्धारित करने के लिए एल्गोरिथ्म के इष्टतम कार्यान्वयन को दर्शाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
सामान्य में, NIQPM .25-44.7 लेकर ऑप्टिकल पथ लंबाई पर मान्य एक विवर्तन सीमित तकनीक है. मान्यकरण n पर प्रदर्शन किया गया था = Fluoromount जी में निलंबित 0.11-9.8 माइक्रोन से व्यास में लेकर 1.596 polystyrene क्षेत्रों (नहीं दिखाया डेटा). कोश?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (OJTM को KGP, OJTM और R01HL101972 को U54CA143906) और एक ओरेगन मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन प्रारंभिक नैदानिक अन्वेषक पुरस्कार (KGP) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. OJTM एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन की स्थापना अन्वेषक (13EIA12630000) है. हम इस काम में इस्तेमाल सेल के नमूने तैयार करने के लिए नाइट कैंसर संस्थान के डॉ. एरिक एंडरसन धन्यवाद.
Materials
| Zeiss Axio Imager 2 microscope | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | Microscope |
| Green filter (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Green filter |
| SlideBook 5.5 software | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | Image acquistion software | |
| Polystyrene microspheres | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Polystyrene spheres |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Mounting media |
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