Identificatie van een Muriene erytroblast subpopulatie verrijkt in Enucleating Events door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie
Summary
Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor het identificeren van een populatie van enucleating orthochromatische erytroblasten van multispectrale beeldvorming flowcytometrie, die een visualisering van de erytroblast enucleatie proces.
Abstract
Erytropoëse in zoogdieren wordt afgesloten met het dramatische proces van enucleatie dat resulteert in reticulocyten formatie. Het mechanisme van enucleatie is nog niet volledig opgehelderd. Een veelvoorkomend probleem bij het bestuderen van de lokalisatie van de belangrijkste eiwitten en structuren binnen enucleating erytroblasten microscopisch is de moeilijkheid om een voldoende aantal cellen die enucleatie nemen. We hebben een nieuwe analyse protocol ontwikkeld met multiparameter high-speed cell imaging in flow (Multi-Spectral Imaging flowcytometrie), een methode die immunofluorescente microscopie gecombineerd met flowcytometrie, teneinde efficiënte manier een groot aantal enucleating gebeurtenissen die toelaat verkrijgen metingen en statistische analyses uit te voeren.
We beschrijven eerst hier twee in vitro erytropoëse cultuur methoden die worden gebruikt om muizen erytroblasten synchroniseren en verhogen de kans op het vastleggen van enucleatie bij The tijd van evaluatie. Vervolgens beschrijven we in detail de kleuring van erythroblasten na fixatie en permeabilisatie om de lokalisatie van intracellulaire eiwitten of lipide rafts bestudeerd worden enucleatie van multispectrale beeldvorming flowcytometrie. Samen met de grootte en DNA/Ter119 vlekken die worden gebruikt om de orthochromatische erytroblasten identificeren, maken we gebruik van de parameters "aspect ratio" van een cel in de bright-field kanaal dat helpt bij de erkenning van langgerekte cellen en "delta centroïde XY Ter119/Draq5 "waarmee de identificatie van cellulaire gebeurtenissen waar het centrum van Ter119 kleuring (ontluikende reticulocyten) is ver uit het centrum van Draq5 kleuring (nucleus ondergaan extrusie), hetgeen wijst op een cel over te ophelderen. De subset van de orthochromatische erythroblast bevolking met een hoge delta zwaartepunt en lage aspect ratio wordt sterk verrijkt in enucleating cellen.
Introduction
Terminale differentiatie in de erytroïde afstammingslijn bij zoogdieren eindigt met de dramatische proces van enucleatie, waardoor de orthochromatische erytroblast verdrijft het membraan omhulde kern (pyrenocyte) 1, het genereren van een reticulocyten 2. Het exacte mechanisme van deze werkwijze, die ook de snelheidsbeperkende stap van succesvolle, grootschalige productie van rode bloedcellen in vitro, is nog niet volledig opgehelderd. De lokalisatie van de belangrijkste eiwitten en structuren binnen enucleating erythroblasten gebaseerd op het gebruik van fluorescente en elektronenmicroscopie 3-5. Dit moeizaam proces resulteert typisch in de identificatie van een beperkt aantal enucleatie evenementen en niet altijd mogelijk zinvolle statistische analyse. Voortbouwend op een werkwijze erytroblast identificatie eerder beschreven door McGrath et al.. 6, hebben wij een nieuwe benadering voor het identificeren en bestuderen enucleatie gebeurtenissen door Multi-Spectral Ima ontwikkeldGing flowcytometrie (multiparameter snelle celweergave in flow, een methode die fluorescentiemicroscopie met flowcytometrie combineert) 7, dat een voldoende waarnemingen kan leveren uitvoeren van metingen en statistische analyse.
Hier beschrijven we eerst twee in vitro erytropoëse kweekmethoden gebruikt om erytroblasten synchroniseren en verhogen de kans op het vastleggen enucleatie bij de evaluatie. Vervolgens beschrijven we in detail de kleuring van erythroblasten na fixatie en permeabilisatie om de lokalisatie van intracellulaire eiwitten of lipide rafts bestudeerd worden enucleatie van multispectrale beeldvorming flowcytometrie.
Monsters worden uitgevoerd op een imaging flowcytometer en de verzamelde cellen adequaat gated om orthochromatische erytroblasten 6 identificeren. Orthochromatische erythroblasten worden vervolgens geanalyseerd op basis van hun verhouding, gemeten helderveld imaGing, versus de waarde voor de parameter delta zwaartepunt XY Ter119-DNA, dat wordt gedefinieerd als de afstand tussen de middelpunten van de gebieden, respectievelijk gekleurd voor Ter119 en DNA. De populatie van cellen met een lage aspect ratio en een hoge delta centroïde XY Ter119/DNA is sterk verrijkt in enucleating cellen. Met behulp van wild-type (WT) erytroblasten versus erytroblasten met Mx-Cre-gemedieerde voorwaardelijke schrapping van Rac1 op Rac2 – / – of gecombineerd Rac2 – / -; RAC3 – / – genetische achtergrond en deze nieuwe analyse protocol van multispectrale beeldvorming flowcytometrie, we onlangs aangetoond dat enucleatie lijkt asymmetrische cytokinese en dat de vorming van een ring actomyosine gedeeltelijk gereguleerd door Rac GTPases is belangrijk voor enucleatie progressie 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
De laatste jaren onderzoek erytroblast enucleatie heeft opgedaan toenemende momentum omdat het de stap van in vitro erytropoëse culturen die het meest moeilijk efficiënt reproduceren om succesvol grootschalige productie van rode bloedcellen ex vivo te bereiken. Tot voor kort, de studie van erythroblast enucleatie gebruikt voornamelijk fluorescentie microscopie en flowcytometrie methoden. Fluorescentiemicroscopiemethodes, zij nuttig bij het identificeren deelnemende moleculen vereisen dagen microscopi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken de Research Doorstroomcytometrie Core in Cincinnati Children's Hospital Research Foundation en Richard Demarco, Sherree vriend, en Scott Mordechai uit de Amnis Corporation (onderdeel van EMD Milllipore) voor deskundige technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health verleent K08HL088126 en R01HL116352 (TAK) en P30 DK090971 (YZ).
Materials
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25G5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
- McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
- Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
- Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
- Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
- Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
- Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
- Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
- Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
