Identificazione di un Murine eritroblasto sottopopolazione Enriched in enucleare Eventi da Multi-spettrale Imaging Citometria a Flusso
Summary
Il presente protocollo descrive un nuovo metodo di identificazione di una popolazione di enucleare eritroblasti ortocromatiche dal flusso di imaging multispettrale citometria, fornendo una visualizzazione del processo di enucleazione eritroblasti.
Abstract
Eritropoiesi nei mammiferi si conclude con il drammatico processo di enucleazione che si traduce nella formazione dei reticolociti. Il meccanismo di enucleazione non è stato ancora completamente chiarito. Un problema comune riscontrato quando si studia la localizzazione delle proteine chiave e strutture all'interno erythroblasts enucleare mediante microscopia è la difficoltà di osservare un numero sufficiente di cellule in fase di enucleazione. Abbiamo sviluppato un protocollo di analisi romanzo utilizzando multiparameter imaging cellulare ad alta velocità del flusso (Multi-Spectral Imaging citometria a flusso), un metodo che combina microscopia a immunofluorescenza con citometria a flusso, al fine di individuare in modo efficiente un numero significativo di eventi enucleare, che permette di ottenere misure ed eseguire analisi statistiche.
Per prima cosa descriviamo qui due vitro l'eritropoiesi metodi di coltura in utilizzati per sincronizzare erythroblasts murini e aumentare la probabilità di catturare l'enucleazione al secoloe momento della valutazione. Poi, si descrive in dettaglio la colorazione degli eritroblasti dopo la fissazione e permeabilizzazione per studiare la localizzazione delle proteine intracellulari o raft lipidici durante l'enucleazione dal flusso di imaging multispettrale citometria. Insieme con dimensioni e DNA/Ter119 colorazione che vengono utilizzati per identificare gli eritroblasti ortocromatiche, utilizziamo i parametri "rapporto" di una cella nel canale in campo chiaro che aiuta nel riconoscimento delle cellule allungate e "delta baricentro XY Ter119/Draq5 "che permette l'identificazione di eventi cellulari in cui è molto distanti dal centro di DRAQ5 colorazione (nucleo fase di estrusione) al centro di Ter119 colorazione (reticolociti nascente), indicando così una cella per enucleate. Il sottoinsieme della popolazione ortocromatica eritroblasto con l'alta baricentro delta e basso rapporto d'aspetto è altamente arricchito in enucleare cellule.
Introduction
Differenziazione terminale all'interno della linea eritroide nei mammiferi si conclude con il drammatico processo di enucleazione, attraverso il quale il eritroblasti ortocromatica espelle suo nucleo membrana-incassato (pyrenocyte) 1, generando un reticolociti 2. L'esatto meccanismo di questo processo, che è anche il fattore limitante di successo, su larga scala, la produzione di globuli rossi in vitro, non è ancora completamente chiarito. La localizzazione di proteine chiave e strutture all'interno eritroblasti enucleare si basa sull'utilizzo di microscopia a fluorescenza ed elettronica 3-5. Questo processo noioso provoca tipicamente l'identificazione di un numero limitato di eventi enucleazione e non sempre consente l'analisi statistica significativa. Espansione su un metodo di identificazione eritroblasto descritto in precedenza da McGrath et al. 6, abbiamo sviluppato un nuovo approccio per identificare e studiare gli eventi enucleazione da Ima Multi-Spectralging Citometria a Flusso (imaging multiparametrico ad alta velocità cella in flusso, un metodo che combina microscopia a fluorescenza con citometria a flusso) 7, che può fornire un numero sufficiente di osservazioni per ottenere misure ed effettuare analisi statistiche.
Qui, descriviamo primi due vitro eritropoiesi metodi di coltura in utilizzati per sincronizzare eritroblasti e aumentare la probabilità di catturare enucleazione al momento della valutazione. Poi descriviamo in dettaglio la colorazione degli eritroblasti dopo fissazione e permeabilizzazione per studiare la localizzazione delle proteine intracellulari o raft lipidici durante l'enucleazione dal flusso di imaging multispettrale citometria.
I campioni vengono eseguiti su un flusso di immagini citometro e le cellule raccolte sono gated appropriato per identificare eritroblasti ortocromatiche 6. Eritroblasti ortocromatiche vengono poi analizzati in base al loro rapporto di aspetto, come misurato in campo chiaro imaging, contro il loro valore per il parametro delta centroide XY Ter119-DNA, che è definita come la distanza tra i centri delle aree colorate per Ter119 e DNA, rispettivamente. La popolazione di cellule con basso rapporto di aspetto e di alta baricentro delta XY Ter119/DNA è altamente arricchito in enucleare cellule. Utilizzando wild-type (WT) eritroblasti contro eritroblasti con delezione Mx-Cre mediata condizionale di Rac1 on Rac2 – / – o combinati Rac2 – / -; Rac3 – / – background genetico e questo protocollo di analisi romanzo di flusso di imaging multispettrale citometria, abbiamo recentemente dimostrato che enucleazione assomiglia citochinesi asimmetrico e che la formazione di un anello actomyosin regolata in parte da Rac GTPasi è importante per la progressione enucleazione 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi anni lo studio di enucleazione eritroblasti ha guadagnato crescente slancio poiché è il passo in vitro culture eritropoiesi in che è più difficile da riprodurre in modo efficiente per ottenere successo, la produzione su larga scala di globuli rossi ex vivo. Fino a poco tempo, lo studio di enucleazione eritroblasti utilizzato principalmente microscopia a fluorescenza e citofluorimetria metodi. Metodi di microscopia a fluorescenza, sebbene utili per identificare molecole parteci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il flusso di Ricerca Citometria Nucleo presso l'Ospedale Pediatrico di Cincinnati Fondazione di Ricerca e Richard Demarco, Sherree amico, e Scott Mordecai dal Amnis Corporation (parte di EMD Milllipore) per il supporto tecnico di esperti. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede K08HL088126 e R01HL116352 (TAK) e P30 DK090971 (YZ).
Materials
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25G5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
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