マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核イベントにおけるマウス赤芽球亜集団エンリッチの同定
Summary
この議定書は、赤芽球摘出プロセスの可視化を提供し、フローサイトメトリーマルチスペクトルイメージングフローによりオルソ赤芽球を除核の集団を同定する新規な方法を説明します。
Abstract
哺乳動物の赤血球生成は、赤血球の形成をもたらす摘出の劇的プロセスを終了します。摘出のメカニズムはまだ完全には解明されていない。顕微鏡による除核の赤芽球内の主要なタンパク質や構造物の局在を研究する際に遭遇する一般的な問題は、摘出を受けている細胞の十分な数を観察することが困難なことである。我々は、フロー内のマルチパラメータの高速セルイメージング（マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー）を効率的に除核事象のかなりの数を識別するために、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法を組み合わせた方法を用いて新規な分析プロトコルを開発し、それはを可能にする測定値を取得し、統計解析を行う。
まず、ここでは、マウス赤芽球を同期し、目に摘出を捕捉する確率を増加させるために使用される2つのin vitro赤血球新生培養法を記載評価のE時間。次に、我々は、マルチスペクトル画像フローサイトメトリーによる除核の間の細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化を研究するために詳細に固定および透過処理後の赤芽球の染色を記載する。サイズおよびオルソ赤芽球を識別するために使用されDNA/Ter119染色と共に、我々は、細長い細胞の認識および「デルタ重心XY Ter119/Draq5に役立つ明視野チャンネル内のセルのパラメータ「アスペクト比」を利用"それはTER119染色（新生網赤血球）の中心は、このように脱核するのに約セルを示す、遠く離れDRAQ5染色（押出を受けて核）の中心からである細胞事象の同定を可能にする。高いデルタ重心と低アスペクト比を有するオルソ赤芽球集団のサブセットは高度に細胞を除核内に濃縮される。
Introduction
哺乳動物の赤血球系統内の端末分化はオルソ赤芽球は赤血球2を生成し 、その膜包ま核（pyrenocyte）1を排出を通して摘出の劇的過程でまとめられる。また、インビトロで赤血球の成功した、大規模生産の律速段階であるこのプロセスの正確なメカニズムは、まだ完全には解明されていない。除核の赤芽球内の主要なタンパク質や構造物の局在は、蛍光および電子顕微鏡3-5の使用に依存している。この面倒なプロセスは、一般的に摘出イベントの限られた数の識別をもたらし、常に意味のある統計的な分析を可能にしていません。マクグラスら 6により、前述の赤芽球の識別方法に拡大し、我々は、マルチスペクトルいまで摘出イベントを特定し、研究する新しいアプローチを開発した測定値を取得し、統計分析を実行するために十分な数の観測値を提供することができるエージングフローサイトメトリー（フローにおける多パラメータの高速セルイメージング、フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡を組み合わせた方法）7。
ここでは、赤芽球を同期し、評価時に摘出を捕捉する確率を増加させるために使用される最初の2つのin vitroでの赤血球形成培養法を記載している。その後、我々は、マルチスペクトル画像フローサイトメトリーによる除核の間の細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化を研究するために詳細に固定および透過処理後の赤芽球の染色を記載する。
サンプルは、フローサイトメーターイメージングフロー上で実行され、回収した細胞をオルソ赤芽球6を識別するために、適切にゲートされています。明いまで測定されるオルソ赤芽球は、次いで、それらのアスペクト比に基づいて分析されそれぞれTER119及びDNAのために染色された領域の中心間の距離として定義されるパラメータデルタ重心XY TER119-DNA、のためのそれらの値に対するエージング。低アスペクト比及び高いデルタ重心XY Ter119/DNAを有する細胞の集団は、高度に細胞を除核内に濃縮される。 – / –たRac2上のRac1のMX-Creを媒介条件の削除と赤芽球に対する野生型（WT）赤芽球を使用して、または組み合わせたRac2 – / – ; RAC3 – / –遺伝的背景およびマルチスペクトル画像のこの新規な分析プロトコルは、フローサイトメトリー、我々は最近、脱核が非対称分裂に似ているし、RACのGTPaseによって部分的に調節アクトミオシン環の形成が摘出進行7のために重要であるとことを明らかにした。
Protocol
Representative Results
Discussion
それはex vivoで赤血球の正常な、大規模生産を達成するために効果的に再現するのが最も困難であるインビトロ赤血球新生培養における工程であるため、近年、赤芽球除核の研究が増加する勢いを得ている。最近まで、赤芽球摘出利用主に蛍光顕微鏡の研究とは、フローサイトメトリー法。蛍光顕微鏡法は、関与する分子を同定するのに有用ではあるが、特定の時点で固定された…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、専門家の技術サポートのためにAmnisコーポレーション（EMD Millliporeの一部）からシンシナティ小児病院研究財団とリチャードDemarcoの、Sherree友人、そしてスコットモルデカイの研究フローサイトメトリーコアに感謝します。この作品は、国立衛生研究所によってサポートされていましたK08HL088126とR01HL116352（TAK）とP30のDK090971（YZ）を付与します。
Materials
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25G5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
- McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
- Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
- Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
- Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
- Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
- Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
- Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
- Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
