Identifikasjon av en Murint erytroblast undergruppe Beriket i Enucleating Hendelser etter Multi-spektral Imaging flowcytometrisystemer
Summary
Den foreliggende protokoll beskriver en ny fremgangsmåte for identifisering av en populasjon av enucleating ortokromatiske erytroblaster ved multispektral avbildning flowcytometri, som gir en visualisering av erytroblast enucleation prosessen.
Abstract
Erytropoese i pattedyr avsluttes med den dramatiske prosessen enucleation som resulterer i retikulocytt-formasjon. Mekanismen enucleation har ennå ikke fullstendig klarlagt. Et vanlig problem som oppstår når man studerer lokalisering av nøkkelproteiner og strukturer innenfor enucleating erytroblaster ved mikroskopi er vanskeligheten med å overholde et tilstrekkelig antall celler som gjennomgår enucleation. Vi har utviklet en ny analyse protokollen ved hjelp av multiparameter høyhastighets celle bildebehandling i flyt (Multi-Spectral Imaging flowcytometri), en metode som kombinerer immunofluorescent mikroskopi med flowcytometri, for å identifisere effektivt et betydelig antall enucleating hendelser, som gjør det mulig å å foreta målinger og utføre statistisk analyse.
Vi først beskrive her to in vitro erytropoiese kultur metoder som brukes for å synkronisere murine erytroblaster og øke sannsynligheten for å fange enucleation på the tid for evaluering. Deretter vi beskriver i detalj farging av erytroblaster etter fiksering og permeabilization for å studere lokalisering av intracellulære proteiner eller lipid flåter under enucleation ved multispektral avbildning strømningscytometri. Sammen med størrelse og DNA/Ter119 flekker som brukes til å identifisere de ortokromatiske erytroblaster, vi utnytter de parameterne "aspect ratio" på en celle i den lyse-feltet kanal som hjelpemidler i erkjennelsen av langstrakte celler og "delta Tyngdepunktet XY Ter119/Draq5 "som gjør det mulig å identifisere cellulære hendelser der sentrum av Ter119 farging (begynnende retikulocytt) ligger langt fra hverandre fra midten av Draq5 farging (nucleus gjennomgår ekstrudering), noe som indikerer en celle om å enucleate. Undergruppe av den ortokromatiske erytroblast befolkning med høy delta Tyngdepunktet og lav sideforhold er høyanriket i enucleating celler.
Introduction
Terminal differensiering innen erythroid avstamning i pattedyr konkluderer med den dramatiske prosessen med enucleation, gjennom hvilket ortokromatiske erytroblast expels sin membran-innkapslet nucleus (pyrenocyte) 1, genererer retikulocytter to. Den nøyaktige mekanisme for denne prosess, som også er det hastighetsbegrensende trinn i vellykket, i stor skala, produksjonen av røde blodceller in vitro, er ennå ikke helt klarlagt. Lokalisering av viktige proteiner og strukturer innenfor enucleating erytroblaster er avhengig av bruk av fluoriserende og elektronmikroskopi 3-5. Denne langtekkelig prosess vanligvis resulterer i identifisering av et begrenset antall enucleation hendelser og ikke tillater alltid menings statistisk analyse. Utvidelse på en metode for erytroblast identifikasjon beskrevet tidligere av McGrath et al. 6, har vi utviklet en ny tilnærming for å identifisere og studere enucleation hendelser av Multi-Spectral ImaGing flowcytometri (multiparameter høyhastighets celle bildebehandling i flyt, en metode som kombinerer fluorescerende mikroskopi med flowcytometri) 7, som kan gi et tilstrekkelig antall observasjoner til å foreta målinger og utføre statistisk analyse.
Her beskriver vi første to in vitro erytropoiese kultur metoder som benyttes for å synkronisere erytroblaster, og øker sannsynligheten for å fange enucleation ved tidspunktet for evaluering. Da vi beskriver i detalj farging av erytroblaster etter fiksering og permeabilization for å studere lokalisering av intracellulære proteiner eller lipid flåter under enucleation ved multispektral avbildning strømningscytometri.
Prøvene blir drevet på en bilde flowcytometer og de innsamlede cellene er gated hensiktsmessig å identifisere ortokromatiske erytroblaster seks. Ortokromatiske erytroblaster blir deretter analysert basert på deres størrelsesforhold, som målt i lysfelt imaging, mot deres verdi for parameteren delta sentroide XY Ter119-DNA, som er definert som avstanden mellom sentrene av de områdene farget for Ter119 og DNA, henholdsvis. Befolkningen i celler med lav sideforhold og høy deltaet Tyngdepunktet XY Ter119/DNA er høyanriket i enucleating celler. Ved hjelp av wild-type (WT) erytroblaster versus erytroblaster med Mx-Cre mediert betinget sletting av Rac1 på Rac2 – / – eller kombinert Rac2 – / -; Rac3 – / – genetisk bakgrunn, og denne nye analyse protokoll for multispektral avbildning flowcytometri, vi nylig demonstrert at enucleation ligner asymmetrisk cytokinese og at dannelsen av en actomyosin ring reguleres delvis av Rac GTPases er viktig for enucleation progresjon 7..
Protocol
Representative Results
Discussion
I de senere år studiet av erytroblast enucleation har fått økende moment siden det er trinnet i in vitro erytropoiese kulturer som er mest vanskelig å reprodusere en effektiv måte for å oppnå vellykket, stor-skala produksjon av røde blodceller ex vivo. Inntil nylig studiet av erytroblast enucleation utnyttes hovedsakelig fluorescens mikroskopi og flowcytometri metoder. Fluorescensmikroskopi metoder, enskjønt nyttig for å identifisere molekyler som deltar, krever dager med mikroskopis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Forsknings flowcytometrisystemer Kjerne ved Cincinnati Children Hospital Research Foundation og Richard Demarco, Sherree venn, og Scott Mordekai fra Amnis Corporation (del av EMD Milllipore) for ekspert teknisk support. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir K08HL088126 og R01HL116352 (TAK) og P30 DK090971 (YZ).
Materials
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25G5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
- McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
- Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
- Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
- Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
- Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
- Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
- Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
- Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
