식물 땀샘은 생물 환경과의 상호 작용에 관여하는 많은 화합물의 생합성 및 분비를 담당하는 특수 구조입니다. 분자 및 생화학적 특징에 대한 연구를 가능하게 하기 위해 식충 식물인 Nepenthes에서 단일 대사 활성 분비샘을 분리하기 위해 기계적 미세준비 기술이 확립되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
많은 식물은 특정 저분자량 화합물 및 단백질의 생산 및 분비에 관여하는 특수 구조를 가지고 있습니다. 이러한 구조는 거의 항상 식물 표면에 국한되어 있습니다. 그 중에는 꿀 또는 선상 상체가 있습니다. 분비된 화합물은 예를 들어 수분 매개자에 대한 유인제 또는 초식 동물에 대한 억제제와 같이 생물 환경과의 상호 작용에 자주 사용됩니다.
여러 측면에서 독특한 땀샘은 식충 식물에서 찾을 수 있습니다. Nepenthes 속의 소위 투수 식물에서 함정 트랩 내부의 이중 기능 땀샘은 한편으로는 먹이 소화에 필요한 모든 효소를 포함하여 소화액을 분비하고 다른 한편으로는 방출 된 영양소를 흡수합니다. 따라서 이 땀샘은 식물의 단백질 분비와 영양소 흡수의 근본적인 분자적, 생화학적, 생리학적 메커니즘을 연구하기 위해 예정된 이상적이고 전문화된 조직을 나타냅니다. 더욱이, 일반적으로 선상 구조를 갖춘 많은 식물에서 생산되는 2차 화합물의 생합성은 분비샘에서 직접 조사할 수 있습니다.
이러한 특수 구조에서 작동하려면 효율적이고 빠르며 대사적으로 활성화되고 다른 조직과의 오염 없이 격리되어야 합니다. 따라서 Nepenthes 소화액에 대한 연구를 위해 기계적 미세화 기법이 개발되어 적용되었습니다. 여기에서는 기계화된 마이크로샘플링 플랫폼을 기반으로 Nepenthes 트랩에서 단일 이중 기능 땀샘을 성공적으로 준비하는 데 사용된 프로토콜이 제시됩니다. 땀샘은 RNA를 준비한 후 PCR 기술에 의한 유전자 발현 분석을 위해 분리되어 직접 더 사용할 수 있습니다.
서론
식물은 저분자 화합물부터 폴리머에 이르기까지 산업 및 제약 분야에서 다양하게 응용되는 매우 광범위한 화합물을 생성합니다. 이러한 화합물은 흔히 고도로 전문화된 구조에 의해 생성 및 분비되는데, 이들 중 상당수는 선모(glandular trichomes)나 밀선(nectaries)과 같이 식물 표면에 위치하거나, 특수세포(idioblasts) 또는 라텍스 및 수지관(latex and resin ducts)과 같이 내부에 위치합니다. 하지만 이러한 전문 분비 구조의 생물학적 특성에 대해서는 상대적으로 알려진 바가 적으며, 다만 모든 유형의 선 조직이 활발한 대사를 나타내는 많은 특징을 보인다는 점이 알려져 있습니다. 특히 Nepenthes와 같은 식충 식물의 선 조직은 식물 세포 생물학의 모델 시스템으로 활용될 수 있습니다1.
식충 식물은 찰스 다윈(Charles Darwin)의 '식충 식물(Insectivorous Plants)'이 출판된 1875년 이후 여러 연구의 대상이 되어 왔습니다.2하지만 최근 몇 년 사이에야 분자 수준의 연구가 수행되었으며, 여전히 우리의 지식은 제한적입니다. 예를 들어, 다음과 같은 속의 식충식물 내 소화액의 단백질 조성은 네펜데스 여전히 완전히....
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프로토콜
1. 식물 재료 준비
- 모든 Nepenthes 종은 화학 생태학을위한 MPI 또는 독일 예나에있는 식물원의 온실에서 자랐습니다.
- 분비 조직을 준비하기 위해 투수를 수확하고 뚜껑, 골막, 미끄러운 부분을 포함한 위쪽 1/3을 제거합니다. 투수는 신선하게 사용하거나 액체 질소에서 냉동 사용할 수 있으며 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
2. 투수 조직의 미세 해부
- 마이크로 샘플링 플랫폼은 실체 현미경과 마이크로 매니퓰레이터로 구성되며, 현미경 본체에 직접 부착되어 3D 조이스틱으로 작동됩니다. 여기에서는 아우레카의 초기 프로토타입이 문서화된 대로 사용되었습니다(그림 2A).
- Nepenthes 투수에서 분비샘을 해부하기 위해 투수는 마이크로핀셋을 사용하여 매니퓰레이터에 부착합니다(그림 2A 및 2B).
- RNA 추출을 위해 모든 기구(면도날, 핀셋, 미세 조작기, 마이크로 집게, 물체 슬라이드)를 RNaseZAP으로 처리합니다.
- RNA 추출을 위해 PCR 튜브에 9 μl nuclease-free wat....
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결과
Nepenthes 포충낭 조직에서 단일 선(gland)을 준비하기 위해 기계식 미세 절제 기술이 개발 및 적용되었습니다. 미세 준비 플랫폼에는 마이크로 조작기에 부착된 미세 핀셋이 장착되어야 하며, 이는 컨트롤 패널로 작동됩니다. 현미경 하에 보이는 개별 선들을 핀셋으로 겨냥하여 선 조직을 잡고 기계적으로 제거할 수 있었습니다(그림 4A).
이후 분석을 위해 선 조직을 PCR 튜브로 직접 옮겼습니다(그림 4B). 선 조직 아래의 식물 관다발계가 드러났으므로 선 제거가 성공적으로 이루어졌음을 확인할 수 있었습니다(그림 4A).
제조 방법의 품질과 효율성을 추가로 입증하고 본 방법의 유용성을 확인하기 위해 PCR 분석을 수행하였습니다. 후보 유전자로 Nepenthes gracilis의 thaumatin-like .......
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토론
오랫동안 식물 분비 구조, 특히 트리코메에 대한 연구는 본질적으로 해부학에 대해 수행되었으며 순전히 설명적이었습니다. 9-11의 리뷰에 요약된 바와 같이 이러한 유형의 출판물이 많이 있습니다. 식물 분비 구조에 대한 우리의 생화학적 및 분자적 지식은 예를 들어 민트 선 트리코메에 대한 몇 가지 초기 주목할만한 연구에도 불구하고 여전히 제한되어 있으며, 이는 선 트리코메가 피하 공간으로 분비되는 모노테르페노이드의 생합성 부위임을 보여줍니다12. 따라서 독립적으로 연구하기 위해서는 도구를 만들고 그러한 특수 기관을 분리하는 기술을 개발해야 합니다. 이러한 땀샘에 직접 접근하면 식물의 분비 시스템에서 생리학적 및 분자 과정을 직접 조사하고 이해할 수 있는 가능성이 제공됩니다. 분비 된 화합물의 생합성과 수송에 중요한 역할을 하는 유전자의 기능과 고도로 전문화된 기관의 발달이 어떻게 조절되는지에 대한 질문도 다룰 수 있습니다.
많은.......
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공개 사항
우리는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
식물을 재배해 준 예나 프리드리히 쉴러 대학교 식물원의 MPI-CE 온실 팀과 지원을 해준 빌헬름 볼란트와 막스 플랑크 협회에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RNAqueous-Micro Kit | Life Technologies GmbH, 독일 | AM1931 | 총 RNA 분리, 50개 시료 |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit | Life Technologies GmbH, 독일 | 61011 | 5 ml Dynabeads Oligo (dT)25 |
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies GmbH, 독일 | 12321D | |
| SuperScript CellsDirect cDNA 합성 시스템 | Life Technologies GmbH, 독일 | 18080-200 | 25 반응 |
| RNaseOUT | Life Technologies GmbH, 독일 | 10777-019 | Rnase 억제제, 5,000 단위 |
| 무작위 헥사머(0.4 μ 지/&무; l) | QIAGEN GmbH, 독일 | 79236 | 100 μ l |
| 10 mM dNTP Mix, 분자 생물학 등급 | Fermentas GmbH, 독일 | R0192 | 1 ml |
| Taq DNA 중합 효소, (재조합) | Fermentas GmbH, 독일 | EP0402 | 10x Taq< / em> 버퍼 (KCl 또는 (NH4< / sub>) 2< / sub>SO 4< / sub>) 및 25 mM MgCl2< / sub> |
| TURBO DNase | Life Technologies GmbH, 독일 | AM2238 | 1,000 units |
| Agarose | Carl Roth GmbH Co. Germany | T846.3 | |
| GeneRuler Low Range DNA ladder, ready-to-use | Fermentas GmbH, | Germany SM1193 | 50 μ g |
| Brilliant II SYBR Green QPCR 마스터 믹스 | Agilent Technologies, Inc., 미국 | 600828 | 단일 키트 |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | R2020 | |
| 면도날 | Carl Roth GmbH Co., Germany | CK08.1 | |
| 핀셋 | Carl Roth GmbH Co., Germany | 2801.1 / 2855.1 | |
| GE NanoVue 분광 광도계 | GE Healthcare Europe GmbH, Germany | 28-9569-62 | |
| Mastercycler gradient | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5331 000.010 | |
| Mx3000P Real-Time PCR System | Stratagene, 미국 | 401403 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis Chamber | Biometra | Discontinued | |
| Micromanipulator | aura optik gmbh | aureka | 마이크로펜치 |
| 실체현미경 | 장착 Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | SteREO Lumar.V12 | AxioCam |
| Lumar Filter set 01 | Carl Zeiss, Microscopy, Jena, Germany | 485001-0000-000 | UV 필터 |
| Lumar Filter set 09 | Carl Zeiss, Microscopy, Jena, Germany | 485009-0000-000 | non-UV filter |
참고문헌
- Adlassnig, W., Peroutka, M., Land, I., Lichtscheidl, I. K. Glands of carnivorous plants as a model system in cell biological research. Acta Bot. Gall. 152, 111-124 (2005).
- Darwin, C. Insectivorous plants. , John Murray. London. (1875).
- Mithöfer, A.
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재인쇄 및 허가
