Vurdere Myogenic respons og karaktivitet I Resistance Mesenteriske Arterier Brug Pressure Myography

Summary

Tryk myography anvendes til at vurdere vasoaktivitet af små arterier, der udvikler vedvarende konstriktion når tryk. Dette håndskrift indeholder en detaljeret protokol til at vurdere i isolerede segmenter af små mesenteriale arterier fra rotter, vasoaktivitet og effekten af ​​intraluminale pres på vaskulær diameter.

Abstract

Små modstandskar snøre og dilatere henholdsvis som respons på forøget eller reduceret intraluminale tryk; dette fænomen kaldes myogen reaktion er en central regulator af lokal blodgennemstrømning. I isobare betingelser små modstand arterier udvikle vedvarende konstriktion kendt som myogen tone (MT), som er en vigtig faktor for systemisk vaskulær modstand (SVR). Derfor ex vivo tryk præparater af små modstand arterier er store redskaber til at studere mikrovaskulære funktion i nær-fysiologiske tilstande. For at opnå dette, er en frisk isoleret intakt segment af en lille modstand arterie (diameter ~ 260 um) monteret på to små glas kanyler og under tryk. Disse arterielle præparater bevarer de fleste in vivo egenskaber og tillader vurdering af vaskulær tone i real-tid. Her giver vi en detaljeret protokol til vurdering vasoaktivitet i tryksatte små modstand mesenteriske arterier fra rotter; disse arterier udviklervedvarende vasokonstriktion – ca. 25% af maksimal diameter – når tryk ved 70 mmHg. Disse arterielle præparater kan anvendes til at undersøge virkningen af ​​testpræparater tinforbindelser på forholdet mellem intra-arterielle tryk og vasoaktivitet og bestemme ændringer i mikrovaskulær funktion i dyremodeller af forskellige sygdomme.

Introduction

Små modstand arterier er vigtige determinanter for SVR og spille en vigtig rolle i patofysiologien af mange sygdomme ^1,2. Tilstande såsom diabetes ^3, graviditet ^4, iskæmi-reperfusion ^5, fedme og hypertension ^6,7 er ofte forbundet med ændret mikrovaskulær funktion. Vaskulær myography kan ikke kun give vigtig indsigt i ændringer i mikrovaskulær funktion i forskellige sygdomme, men også at identificere terapeutiske mål og evaluere effektiviteten af ​​vasoaktive forbindelser. Vaskulær funktion er blevet undersøgt ved anvendelse af isolerede små arterier under isometriske eller isobare fartøjsforholdene ^8. Detaljeret beskrivelse af isometrisk myography leveres andetsteds ^9. Men der er forskelle i data fra isometrisk versus isobare præparater ^10-12. Da tryksatte arterielle præparater tillader studiet af mikrovaskulære funktion i nær-fysiologiske betingelser, denopnåede resultater kan korrelere bedre med in vivo adfærd vaskulære seng ^8,13.

I 1902 Bayliss først beskrevet virkningen af transmural pres på vaskulær diameter ^14. Han bemærkede i små modstandskar fra forskellige vaskulære senge af kaniner, katte og hunde, et fald i trykket blev efterfulgt af vasodilatation, og en stigning i trykket blev efterfulgt af vasokonstriktion. Dette fænomen er kendt som myogene respons. Bayliss og efterfølgende undersøgere observeret, at i isobare betingelser lille modstandskar udvikle vedvarende konstriktion kaldet MT ^15,16. Både myogene respons og MT kan vurderes ved anvendelse af tryk myography (PM) -teknik. PM anvendes primært til at bestemme vasoaktivitet af små arterier, vener og andre fartøjer. Ud over at vurdere effekten af ​​vasoaktive forbindelser på vaskulær diameter, PM – som navnet indikerer – bruges til at vurdere intravaskulær pres-medieret changes på vaskulær diameter. I løbet af de seneste årtier fremskridt i computersoftware, der forbedrede video mikroskopi og glaspipette trækker, har gjort PM lettere at udføre. Imidlertid dissektion af levedygtige intakte segmenter af små blodkar forbliver kedelig og undertiden udfordrende. Her skitsere en detaljeret protokol til at studere myogen respons i små mesenteriske modstand arterier isoleret fra rotter.

Protocol

De viste eksempler er fra forsøg godkendt af IACUC på Georgia Regents University – Protokol nr: # 2011-0408 1. Fremstilling af reagenser Forbered dissektion løsning lager: For 500 ml lager dissektion løsning (5x), opløses 21.18 g NaCl, 0,875 g KCI, 0,739 g MgSO4, 1,049 g MOPS og 0,019 g EDTA i 450 ml Milli-Q vand. Juster pH til 7,3-7,4 ved anvendelse af 1 N NaOH. Fyldes op til 500 ml med Milli-Q vand. Stamopløsning kan opbevares op til 7-10 dage. Se tabel …

Representative Results

Skematisk fremstilling af en typisk tryk myograf set-up er vist i figur 1. De to ender af beholderen er kanyleret med et glas mikropipette og fastgøres med suturer på begge sider. Via en slange og en åben stophane, er en kanyle forbundet til en servostyret tryk-regulator; den anden kanyle er forbundet til en lukket stophane. Kammeret er perfunderet med PSS og vaskulær diameter ændringer observeret af et omvendt mikroskop forbundet til et CCD-kamera. Den arterielle segme…

Discussion

Kritiske trin, fejlfinding og ændringer

I en typisk isobarisk præparat fartøj, er arterien under tryk ved 70 mmHg mellem to glas kanyler perfunderet med varmt (37 ° C) PSS. Efter 30-45 min, arterier udvikle MT, kendetegnet ved spontan fald i diameter, der stabiliserer i 20-30 min. De modstandskar fra forskellige kar udvikle variabel MT. For eksempel rotte modstand mesenteriske arterier udvikle MT ~ 25% af PD, mens cremastric arterier kan opnå MT ~ 40% af PD. Arterier, der ikke udvikler MT …

Materials

			Chemical
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
MOPS	Sigma Aldrich	M5162
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126
Potassium chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 )	Sigma Aldrich	S6014
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881
Sodium nitroprusside	Sigma Aldrich	13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma Aldrich	S9638
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P8574
			Table 1.
			Physiological salt solution (1000 ml) mM KCl 4.9 0.365 g NaCl 112 6.545 g MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g KH2PO4 1.2 0.163 g Glucose 11.5 2.072 g NaHCO3 26 2.184 g HEPES 10 2.383 g CaCl2 2 2 ml (1M stock) De-ionized water 998 ml Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM KCl 4.9 0.036 g NaCl 112 0.645 g MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g KH2PO4 1.2 0.016 g Glucose 11.5 0.207 g NaHCO3 26 0.218 g HEPES 10 0.238 g EGTA 0.39 0.015 g Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g De-ionized water 100 ml Dissection solution, stock (500 ml) mM NaCl 145 21.18 g KCl 4.7 0.875 g MgSO4 1.2 0.739 g MOPS 2 1.049 g EDTA 0.02 0.019 g De-ionized water 500 ml Working dissection solution (100 ml) mM Dissection solution stock 20 ml Glucose 1.2 0.091 g NaH2PO4 5 0.016 g Sodium pyruvate 2 0.022 g CaCl2 2 0.2 ml (1M stock) De-ionized water 79.8 ml
			Table 2. Composition of Experimetnal solutions
			Equipment
CCD Monochrome Camera	The imaging Source	DMK 21AU04
Single inline solution heater	Warner Instruments	64-0102
Thermistor	Warner Instruments	64-0108
Dual automatic temperature controller	Warner Instruments	TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Fluorescence System Interface	IonOptix	model FSI-700
Forceps and scissors	World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis	IonOptix	Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing	Silastic	508-005
Male Sprague Dawley rat	Harlan Laboratories
Master flex console drive	Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System	Millipore	ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture	Ethicon	9007G
Photometry and Dimensioning Microscope	Motic	AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer	Living Systems Instrumentation	PS-200
Stereomicroscope	Nikon Instruments Inc	SMZ660
Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1
Dissection dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW120-6
Microforge	Stoelting	51550
			Table 3.