Beurteilung Myogenic Antwort und Vasoaktivität In Resistance Mesenterialarterien Mit Druck Myographie

Summary

Druck Myographie wird verwendet, um Vasoaktivität der kleinen Arterien, die anhaltende Verengung zu entwickeln, wenn unter Druck zu bewerten. Diese Handschrift ein detailliertes Protokoll, um in isolierten Segmenten der kleinen Mesenterialarterien von Ratten, Vasoaktivität und die Wirkung der intraluminale Druck auf die Gefäßdurchmesser zu bewerten.

Abstract

Geringen Widerstand Arterien verengen und zu dilatieren bzw. in Reaktion auf erhöhte oder verringerte intraluminale Druck; Dieses Phänomen, das als myogene Reaktion bekannt ist ein Schlüsselregulator der lokalen Durchblutung. In isobar kleinen Widerstand Arterien anhaltend in Verengung als myogene Tonus (MT), die eine wichtige Determinante für den systemischen Gefäßwiderstand (SVR) ist bekannt. Daher ex vivo unter Druck stehende Präparate von kleinen Widerstand Arterien sind wichtige Werkzeuge, um mikrovaskulären Funktion in nahezu physiologische Zustände zu studieren. Um dies zu erreichen, wird eine frisch isolierte intakte Segment eines kleinen Widerstandsader (Durchmesser ~ 260 & mgr; m) auf beiden Glas Kanülen und unter Druck gelagert ist. Diese Arterienpräparate behalten die meisten in vivo Eigenschaften und Genehmigung Beurteilung der Gefäßtonus in Echtzeit. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Beurteilung Vasoaktivität in Druck kleiner Widerstand Mesenterialarterien von Ratten; diese Arterien entwickelnpermanente Vasokonstriktion – etwa 25% des maximalen Durchmessers – wenn sie bei 70 mm Hg Druck. Diese arterielle Zubereitungen können verwendet werden, um die Wirkung der Verbindungen auf die experimentellen Verhältnis zwischen intra-arteriellen Blutdruck und Vasoaktivität untersuchen und zu bestimmen, Änderungen der mikrovaskulären Funktion in Tiermodellen von verschiedenen Krankheiten.

Introduction

Kleinen Widerstand Arterien sind entscheidend für SVR und spielen eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von vielen Krankheiten ^1,2. Erkrankungen wie Diabetes ^3, Schwangerschaft ^4, Ischämie-Reperfusion ^5, Fettleibigkeit und Bluthochdruck ^6,7 werden häufig mit veränderten Mikrogefäßfunktion. Vascular Myographie können nicht nur wichtige Erkenntnisse über Änderungen der mikrovaskulären Funktion bei verschiedenen Krankheiten, sondern auch dazu beitragen, therapeutische Ziele und bewerten die Wirksamkeit von vasoaktiven Verbindungen. Kreislauf-Funktion wurde unter Verwendung von isolierten kleinen Arterien unter isometrischen oder isobaren Bedingungen Gefäß ⁸ untersucht. Detaillierte Beschreibung der isometrischen Myographie anderswo ⁹ vorgesehen. Jedoch gibt es Unterschiede in den Daten aus isometrischen gegen isobaren Präparationen ^10-12 erhalten. Da unter Druck Arterienpräparate erlauben die Untersuchung der mikrovaskulären Funktion in nahezu physiologischen Bedingungen, diegewonnenen Erkenntnisse können besser mit In-vivo-Verhalten der Gefäßbett ^8,13 korrelieren.

Im Jahr 1902 die Wirkung von transmuralen Druck zuerst beschrieben Bayliss auf Gefäßdurchmesser ^14. Er beobachtete, in kleinen Widerstand Arterien von verschiedenen vaskulären Betten von Kaninchen, Katzen und Hunden, die eine Abnahme des Drucks wurde durch Vasodilatation gefolgt, und eine Zunahme der Druck wurde durch Vasokonstriktion gefolgt. Dieses Phänomen ist als myogenen Reaktion bekannt. Bayliss und nachfolgende Forscher festgestellt, dass in isobaren Bedingungen geringen Widerstand Arterien entwickeln nachhaltige Verengung als MT ^15,16 bekannt. Sowohl myogenen Antwort und MT kann durch Verwendung von Druck Myographie (PM) -Verfahren bewertet. PM wird in erster Linie verwendet, um Vasoaktivität der kleinen Arterien, Venen und anderen Fahrzeugen zu bestimmen. Neben der Beurteilung der Wirkung von vasoaktiven Verbindungen auf Gefäßdurchmesser, PM – wie der Name sagt – wird verwendet, um intravaskuläre Druck-vermittelte ch bewertenanges auf Gefäßdurchmesser. In den letzten Jahrzehnten Fortschritte in der Computer-Software, die eine verbesserte Videomikroskopie und Glaspipette Ziehen, haben PM leichter durchzuführen hat. Jedoch bleibt Dissektion von lebensfähigem intaktem Segmente kleiner Blutgefäße mühsam und manchmal schwierig. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur myogenen Reaktion in kleinen mesenterialen Widerstandsarterien von Ratten isoliert studieren.

Protocol

Die hier gezeigten Beispiele sind aus Experimenten von IACUC in Georgia Regents Universität zugelassen – Protokoll Nr: # 2011-0408 1. Vorbereitung der Reagenzien Bereiten Sezieren Lösung Lager: Für 500 ml Stammlösung Dissektion (5x), lösen sich 21,18 g NaCl, 0,875 g KCl, 0,739 g MgSO 4, 1,049 g MOPS und 0,019 g EDTA in 450 ml Milli-Q-Wasser. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 unter Verwendung von 1 N NaOH. Stellen Sie die Lautstärke auf 500 ml mit Milli-Q-Wasser. Stammlösun…

Representative Results

Schematische Darstellung eines typischen Druck Myographions Aufbau ist in Abbildung 1 dargestellt. Die beiden Enden des Schiffes sind mit einer Glasmikropipette kanüliert und mit Nähten auf beiden Seiten gesichert. Über eine Rohrleitung und einer offenen Absperrhahn wird eine Kanüle in eine servogesteuerte Druckregler verbunden ist; die andere Kanüle in einen geschlossenen Absperrhahn verbunden. Die Kammer ist mit PSS und Gefäßdurchmesser Änderungen werden durch ein umgekehrtes Mikroskop, um ein…

Discussion

Kritischen Schritte, Fehlersuche und Änderungen

In einem typischen isobaren Gefäß Vorbereitung wird die Arterie bei 70 mmHg zwischen zwei Glas Kanülen mit warmem (37 ° C) PSS perfundiert Druck gesetzt. Nach 30-45 min, Arterien entwickeln MT, gekennzeichnet durch spontane Abnahme des Durchmessers, die in 20-30 Minuten stabilisiert. Die Widerstandsarterien aus verschiedenen Gefäßbetten entwickeln variablen MT. Zum Beispiel Ratte Widerstand Mesenterialarterien entwickeln MT ~ 25% der PD, w?…

Materials

			Chemical
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
MOPS	Sigma Aldrich	M5162
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126
Potassium chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 )	Sigma Aldrich	S6014
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881
Sodium nitroprusside	Sigma Aldrich	13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma Aldrich	S9638
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P8574
			Table 1.
			Physiological salt solution (1000 ml) mM KCl 4.9 0.365 g NaCl 112 6.545 g MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g KH2PO4 1.2 0.163 g Glucose 11.5 2.072 g NaHCO3 26 2.184 g HEPES 10 2.383 g CaCl2 2 2 ml (1M stock) De-ionized water 998 ml Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM KCl 4.9 0.036 g NaCl 112 0.645 g MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g KH2PO4 1.2 0.016 g Glucose 11.5 0.207 g NaHCO3 26 0.218 g HEPES 10 0.238 g EGTA 0.39 0.015 g Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g De-ionized water 100 ml Dissection solution, stock (500 ml) mM NaCl 145 21.18 g KCl 4.7 0.875 g MgSO4 1.2 0.739 g MOPS 2 1.049 g EDTA 0.02 0.019 g De-ionized water 500 ml Working dissection solution (100 ml) mM Dissection solution stock 20 ml Glucose 1.2 0.091 g NaH2PO4 5 0.016 g Sodium pyruvate 2 0.022 g CaCl2 2 0.2 ml (1M stock) De-ionized water 79.8 ml
			Table 2. Composition of Experimetnal solutions
			Equipment
CCD Monochrome Camera	The imaging Source	DMK 21AU04
Single inline solution heater	Warner Instruments	64-0102
Thermistor	Warner Instruments	64-0108
Dual automatic temperature controller	Warner Instruments	TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Fluorescence System Interface	IonOptix	model FSI-700
Forceps and scissors	World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis	IonOptix	Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing	Silastic	508-005
Male Sprague Dawley rat	Harlan Laboratories
Master flex console drive	Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System	Millipore	ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture	Ethicon	9007G
Photometry and Dimensioning Microscope	Motic	AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer	Living Systems Instrumentation	PS-200
Stereomicroscope	Nikon Instruments Inc	SMZ660
Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1
Dissection dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW120-6
Microforge	Stoelting	51550
			Table 3.