Het beoordelen Myogene Response en vasoactiviteit In Resistance Mesenteriale slagaders behulp Pressure myography

Summary

Pressure myography wordt gebruikt om vasoactiviteit van kleine slagaders die aanhoudende vernauwing ontwikkelen wanneer onder druk te beoordelen. Het manuscript geeft een gedetailleerd protocol te beoordelen geïsoleerde segmenten van kleine mesenterische arteriën van ratten vaatactiviteit en het effect van de intraluminale druk op de vasculaire diameter.

Abstract

Kleine weerstand slagaders vernauwen en verwijden respectievelijk bij toenemende intraluminale of verlaagde druk; dit fenomeen bekend als myogene respons is een belangrijke regulator van de lokale doorbloeding. In isobare omstandigheden kleine weerstand slagaders ontwikkelen aanhoudende vernauwing bekend als myogene toon (MT), dat is een belangrijke determinant van de systemische vasculaire weerstand (SVR). Vandaar, ex vivo onder druk bereidingen van kleine weerstand slagaders zijn belangrijke instrumenten om microvasculaire functie te bestuderen in de buurt-fysiologische toestanden. Hiertoe wordt een vers geïsoleerde intacte segment van een kleine weerstand arterie (diameter ~ 260 urn) aangebracht op twee kleine glazen canules en onder druk. Deze arteriële voorbereidingen behouden meest in vivo kenmerken en vergunning beoordeling van vasculaire tonus in real-time. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van vasoactiviteit in onder druk kleine weerstand mesenterica slagaders van ratten; deze slagaders ontwikkelinglangdurige vasoconstrictie – ongeveer 25% van de maximale diameter – bij een druk van 70 mmHg. Deze arteriële preparaten kunnen worden gebruikt om het effect van de onderzochte verbindingen op tussen intra-arteriële druk en vaatactiviteit onderzoeken en vaststellen veranderingen in microvasculaire functie bij diermodellen van verschillende ziekten.

Introduction

Kleine weerstand slagaders zijn belangrijke determinanten van SVR en spelen een belangrijke rol in de pathofysiologie van vele ziekten ^1,2. Aandoeningen zoals diabetes ^3, zwangerschap ^4, ischemie-reperfusie ^5, obesitas en hypertensie ^6,7 worden vaak geassocieerd met veranderde microvasculaire functie. Vasculaire myography kunnen niet alleen belangrijke inzichten in veranderingen in microvasculaire functie bij verscheidene ziekten, maar ook helpen bij het identificeren therapeutische targets en het effect van vasoactieve verbindingen te evalueren. Vaatfunctie is onderzocht met behulp van geïsoleerde kleine slagaders onder isometrisch of isobare omstandigheden vat ^8. Gedetailleerde beschrijving van isometrische myography elders ⁹ verschaft. Er zijn echter verschillen in de gegevens die zijn verkregen uit isometrische versus isobare voorbereidingen ^10-12. Aangezien onder druk arteriële voorbereidingen kan de studie van microvasculaire functie in de buurt-fysiologische omstandigheden, deverkregen bevindingen kunnen beter met in vivo gedrag van de vasculaire bed ^8,13 correleren.

In 1902 eerst beschreven Bayliss het effect van transmurale druk op vasculaire diameter ^14. Hij merkte in kleine weerstand arteriën uit verschillende vasculaire bedden van konijnen, katten en honden die een drukafname gevolgd door vasodilatatie en een verhoging van de druk werd gevolgd door vasoconstrictie. Dit fenomeen wordt myogene reactie. Bayliss en daaropvolgende onderzoekers opgemerkt dat in isobare omstandigheden kleine weerstand slagaders ontwikkelen aanhoudende vernauwing bekend als MT ^15,16. Zowel myogene reactie en MT kunnen worden bepaald door de druk myography (PM) techniek. PM wordt voornamelijk gebruikt om vaso- activiteit van kleine slagaders, aders en andere vaartuigen bepalen. Naast het effect van vasoactieve verbindingen op vasculaire diameter, PM – zoals de naam al aangeeft – wordt gebruikt om de intravasculaire druk gemedieerde ch beoordelenanges op vasculaire diameter. In de afgelopen decennia is de vooruitgang in de computer software, die verbeterde video microscopie en glazen pipet trekken PM hebben gemaakt gemakkelijker uit te voeren. Echter, dissectie van levensvatbare intacte segmenten van kleine bloedvaten blijft vervelend en soms uitdagend. Hier schetsen we een gedetailleerd protocol om myogene respons in kleine mesenteriale weerstand slagaders geïsoleerd van ratten te bestuderen.

Protocol

De hier getoonde voorbeelden zijn van experimenten van IACUC goedgekeurd Georgia Regents University – Protocol nr: # 2011-0408 1. Bereiding van reagentia Bereid dissectie oplossing stock: Voor 500 ml van de dissectie-oplossing (5x), ontbinden 21.18 g NaCl, 0,875 g KCI, 0,739 g MgSO4, 1,049 g MOPS en 0,019 g EDTA in 450 ml Milli-Q water. Pas de pH op 7,3-7,4 met behulp van 1 N NaOH. Maak het volume tot 500 ml met Milli-Q water. De oplossing kan worden bewaard tot 7-10 da…

Representative Results

Schematische weergave van een typische druk myograaf opstelling is weergegeven in figuur 1. De twee uiteinden van het vaartuig canule met een glazen micropipet en vastgezet met hechtingen aan beide zijden. Via slangen en een open kraan, wordt een canule verbonden met een servo-gestuurde druk-regulator; de andere canule is verbonden met een gesloten kraan. De kamer wordt geperfuseerd met PSS en vasculaire diameter zijn beschadigd door een omgekeerde microscoop verbonden met een CCD camera. <p class="…

Discussion

Kritische stappen, het oplossen van problemen en wijzigingen

In een typische bereiding isobare vat, wordt de slagader op druk 70 mmHg tussen twee glazen canules geperfuseerd met warm (37 ° C) PSS. Na 30-45 min, bloedvaten ontwikkelt MT, gekenmerkt door spontane verlaging in diameter die stabiliseert in 20-30 min. De weerstand slagaders van verschillende vasculaire bedden ontwikkelen variabele MT. Bijvoorbeeld weerstand rat mesenteriale slagaders ontwikkelen MT ~ 25% van de PD, terwijl cremastr…

Materials

			Chemical
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
MOPS	Sigma Aldrich	M5162
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126
Potassium chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 )	Sigma Aldrich	S6014
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881
Sodium nitroprusside	Sigma Aldrich	13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma Aldrich	S9638
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P8574
			Table 1.
			Physiological salt solution (1000 ml) mM KCl 4.9 0.365 g NaCl 112 6.545 g MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g KH2PO4 1.2 0.163 g Glucose 11.5 2.072 g NaHCO3 26 2.184 g HEPES 10 2.383 g CaCl2 2 2 ml (1M stock) De-ionized water 998 ml Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM KCl 4.9 0.036 g NaCl 112 0.645 g MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g KH2PO4 1.2 0.016 g Glucose 11.5 0.207 g NaHCO3 26 0.218 g HEPES 10 0.238 g EGTA 0.39 0.015 g Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g De-ionized water 100 ml Dissection solution, stock (500 ml) mM NaCl 145 21.18 g KCl 4.7 0.875 g MgSO4 1.2 0.739 g MOPS 2 1.049 g EDTA 0.02 0.019 g De-ionized water 500 ml Working dissection solution (100 ml) mM Dissection solution stock 20 ml Glucose 1.2 0.091 g NaH2PO4 5 0.016 g Sodium pyruvate 2 0.022 g CaCl2 2 0.2 ml (1M stock) De-ionized water 79.8 ml
			Table 2. Composition of Experimetnal solutions
			Equipment
CCD Monochrome Camera	The imaging Source	DMK 21AU04
Single inline solution heater	Warner Instruments	64-0102
Thermistor	Warner Instruments	64-0108
Dual automatic temperature controller	Warner Instruments	TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Fluorescence System Interface	IonOptix	model FSI-700
Forceps and scissors	World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis	IonOptix	Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing	Silastic	508-005
Male Sprague Dawley rat	Harlan Laboratories
Master flex console drive	Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System	Millipore	ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture	Ethicon	9007G
Photometry and Dimensioning Microscope	Motic	AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer	Living Systems Instrumentation	PS-200
Stereomicroscope	Nikon Instruments Inc	SMZ660
Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1
Dissection dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW120-6
Microforge	Stoelting	51550
			Table 3.