זחלי דרוזופילה הם מערכת מודל אטרקטיבית עבור הדמיה חיה בשל הציפורן השקופה שלהם וגנטיקה חזקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנצל את מכשיר PDMS שכבה אחת, שנקרא 'שבב הזחל' עבור הדמיה חיה של תהליכים תאיים בתוך הנוירונים של 3 זחלי דרוזופילה instar rd.
הדמיה חיה היא טכניקה חשובה לחקר תהליכים ביולוגיים של תא, אולם זה יכול להיות מאתגר בבעלי חיים. הציפורן השקופה של זחל דרוזופילה עושה את זה אורגניזם מודל אטרקטיבי למחקרי הדמיה לחיות. עם זאת, אתגר חשוב עבור טכניקות הדמיה חיה הוא לשתק noninvasively ולמקם את בעלי חיים במיקרוסקופ. פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה וקלה לשימוש עבור לשתק והדמית זחלי דרוזופילה על polydimethylsiloxane (PDMS) מכשיר microfluidic, שאנו מכנים 'שבב הזחל'. שבב הזחל מורכב מmicrochamber PDMS דוקים שמצורף לcoverslip זכוכית דק, אשר, על פי בקשה של ואקום באמצעות מזרק, שמגביל את בעל החיים ומביא מבני הגחון כגון חוט העצב, עצבים מגזרי, וגוף קיר שרירים, בתוך בסמיכות לcoverslip. זה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה, וחשוב מכך, ימנע את השימוש של anesthetics וכימיקלים, המאפשר הלימוד של מגוון רחב של תהליכים פיסיולוגיים. מאז זחלים להתאושש בקלות מהקיבוע, הם יכולים להיות חשופים בקלות לפגישות הדמיה מרובות. זה מאפשר למחקרים ארוכי טווח על קורסי זמן שנעו בין שעות עד ימים. פרוטוקול זה מתאר צעד אחר הצעד כיצד להכין את השבב וכיצד לנצל את השבבים עבור הדמיה חיה של אירועים עצביים ב3 זחלי instar rd. אירועים אלה כוללים את ההובלה המהירה של האברונים באקסונים, תגובות סידן לפציעה, ומחקרי הזמן לשגות של הסחר של חלבוני תמונה להמרה על פני מרחקים ארוכים וסולמות זמן. יישום נוסף של השבב הוא ללמוד משובי ותגובות ניווניות לפגיעה באקסון, ולכן החלק השני של פרוטוקול זה מתאר נוהל חדש ופשוט לפציעתם של האקסונים בעצבים היקפיים על ידי למחוץ עצב מגזרי.
זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, נוצל כאורגניזם מודל במשך 100 שנים, והוכיח סייע בהגדרת איתות בסיסית ומסלולים התפתחותיים הנשמרים מחסרי חוליות לאדם. ההדמיה חיה היא גישה חשובה ללימוד מנגנונים תאיים, ותכנית הגוף הפשוטה וציפורן שקופה של זחל דרוזופילה הופכת אותו למערכת אטרקטיבית להדמית חיה, במיוחד שכן יש כלים גנטיים רבים זמינים לביטוי חלבונים מתויגים fluorescently בסוגי תאים ספציפיים.
אתגר חשוב עבור טכניקות הדמיה חיה הוא לשתק noninvasively ולמקם את בעלי חיים למיקרוסקופ. גישות קיבוע קונבנציונליות כוללות נתיחה 1,2 או שימוש בכלורופורם, אשר שניהם להרוג את בעלי החיים. ההרדמה אתר 4 וisofluorane 5-8 היו בשימוש גם. בעוד הרדמה מספקת יתרונות רבים, הם גם מעכבים את הפעילות עצבית ופיזיולוגיה חשובה (כולל פעימות הלב) 9-11, ולכן יכול להשפיע על התהליך למד וליצור לחץ על בעלי החיים. ישנם גם חששות בטיחות אדם לעבודה עם אתר וisofluorane.
אנחנו פיתחנו שיטה ללא שימוש בסמים כדי לשתק זחלי דרוזופילה במכשיר אחד PDMS microfluidic השכבה, שאנו מכנים 'שבב הזחל' 12. פרוטוקול זה יתאר כיצד להשיג או לעשות שבב הזחל, ואיך לנצל אותו להדמיה לחיות בתחילת מבוימת זחלי instar 3 rd. השבב מורכב מmicrochamber דוקים, אשר, על פי בקשה של ואקום באמצעות מזרק, שמגביל את בעל החיים באמצעות כוח מכאני עדין. שיטת הקיבוע מביאה מבני הגחון כגון חוט העצב, עצבים מגזרי, וקיר שרירי גוף, בתוך בסמיכות לcoverslip זכוכית. זה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של מבנים כאלה עם aper המספרי גבוהture יעדים (ההגדלה גבוהה).
יתרונות של שבב הזחל על פני שיטות קונבנציונליות אחרות כוללים את הפעולות הבאות: (i) שימוש בשבב הזחל מחליף את השימוש בכימיקלים, המאפשר הדמיה vivo של חיות unanesthetized. (Ii) זחלים להתאושש מייד לאחר שחרורו מהשבב (בניגוד לתקופת החלמה 2 שעות עבור 8,13 isofluorane). זה מאפשר הדמיה על סולמות זמן רחבים, החל מאלפיות שניים לדקות, שעות וימים. (Iii) השימוש של PDMS, שהוא חומר חדיר גז, מאפשר לדיפוזיה מתמדת של חמצן / אוויר מהסביבה אל תוך גוף הזחל. (Iv) השבב הוא קל ובטוח לשימוש, ו( v) זה לשימוש חוזר, ויכול להיות מיוצר בעלות מינימאלית.
בנוסף להוראות לשימוש בשבב הזחל, פרוטוקול זה יספק כמה דוגמאות של השימוש בו כדי ללמוד אירועים עצביים ב3 זחלי instar rd. אלה כוללים הדמיה חיה של axonaתחבורת ליטר, תגובות סידן לפציעה, ומחקרי הזמן לשגות של הסחר של חלבוני תמונה להמרה על פני מרחקים ארוכים וסולמות זמן.
יישום נוסף של השבב הוא ללמוד את תגובות עצביות לפגיעה באקסון. לשם כך הליך נוסף מתואר (בחלק 3) לפציעתם אקסונים בתוך עצבים היקפיים על ידי למחוץ עצב מגזרי. assay הפשוט זה יכול להתבצע גם במהירות וreproducibly תחת סטראו לנתיחה סטנדרטי, המאפשר לבעלי חיים רבים להיות מעובד באותו הזמן. תגובות תאיות לפציעה ניתן ללמוד על ידי הדמיה לחיות בשבב הזחל.
ביצוע או קבלת שבב הזחל:
שבב הזחל מורכב מבלוק PDMS (שמכונה 'שבב PDMS') המצורף לcoverslip זכוכית. הפרוטוקול בשלב 1 מתאר את ההליך להכנת ושימוש בשבבי זחל, בהנחה שעובש SU-8 הוא זמין. עובש SU-8 microfabricated ידי photolithographically דפוסי שכבת 140 מיקרומטר עבה SU-8 photoresist על פרוסות סיליקון (לפרטים ראו Ghannad-Rezaie et al. 12). כmicrofabrication של עובש SU-8 דורש גישה לציוד מיוחד, אנו ממליצים להזמין אותו ממתקן microfabrication (למשל. מתקן LNF באוניברסיטת 14 מישיגן), או מיציקה על ידי שליחתם תכנון שבבים המסופק כקובץ נלווה. אם האדם רוצה לשנות את העיצוב של שבב PDMS (למשל לשימוש עם זחלים בגדלים שונים), תוכנות CAD שמטפלת בקבצי DXF (למשל אוטוקאד) יכול לשמש. SU-8 עובש יכול להיות גם בתוך הבית בהתאם להוראות בMondal et al. 27 קוראים רבים עשויים למצוא אותו נוח פשוט להשיג מדגם שבב PDMS לנסות את הטכניקה לפני בודה שבבים משלהם. זה יהיה זמין באופן חופשי על פי דרישה.
שימוש ב'שבב הזחל 'microfluidic עבור הדמיה חיה:
שיטת הקיבוע בשבב הזחל תמנע את השימוש בחומרי ההרדמה, ובמקום כרוך בלחץ, באמצעות היישום של ואקום, להגביל את תנועתו של בעל החיים. בעוד בעלי חיים יכולים לשרוד חוסר תנועה בשבב במשך שעות מרובות 12, לתקופה קצרה יותר חוסר תנועה (5-15 דק ') מומלץ. זה מספיק זמן להדמית אירועים רבים תאיים של עניין, לרבות שינויים בסידן תוך תאי, או בתחבורת אקסון מהירה. זה גם מספיק זמן למניפולציות רצויים בבעלי חיים, כגון מייקרו לייזר מבוסס, photobleaching, וphotoconverשיאון.
כדי ללמוד את האירועים על פני תקופת זמן ארוכה יותר בחיה אחת לאורך זמן, ניתן להציב חיות לשבב וצלמו מספר פעמים, מופרדות על ידי תקופות של מנוחה. צלחות אגר מיץ ענבים הן אידיאליים למנוחה בין פגישות הדמיה, כפי שהם מספקים מקור מזון קל ולחות. פגישות הדמיה מרובות עושות משפיעות על הישרדות זחל לתואר, שכן כל מפגש כרוך בסיכון כלשהו לפגיעה בבעלי החיים (ראה חלק 2 בפתרון בעיות, בהמשך). בעלי חיים ניתן הדמיה באופן שיגרתי> 5 פעמים במשך יומיים עם שיעור הישרדות של יותר מ 50%. מאז החיות אינן מורדמים, הם בריאים וניעה מייד לאחר שחרורו של הוואקום בשבב. לפיכך, אין צורך בזמן התאוששות בין פגישות הדמיה, ולכן מרווח הזמן בין הפגישות הוא גמיש ויכול להיות מותאם למטרות הניסוי.
פתרון בעיות:
הטכני הנפוץ ביותר הואתובעת עם זחל שבב ופתרונות מומלצים הם כדלקמן:
(1) בעלי החיים הוא נעו יותר מדי. יותר מדי ניידות יכולה להפריע למטרות ההדמיה. הסיבות הנפוצות ביותר לכך בשבב הזחל הן) בעלי החיים הוא קטנים מדי עבור השבב, או ב) לחץ הוואקום מיושם במהלך שלב הקיבוע נפגעת. שבב הזחל שתואר בפרוטוקול זה מיועד לתחילת מבוימת זחלי instar 3 rd. הגודל האופטימלי לבעלי החיים הוא 3.5-4 מ"מ האורך (לאורך ציר anteroposterior). כדי להבטיח שלחץ הוואקום מספיק, למשוך מיליליטר 2-2.5 המזרק, או עד שההתנגדות מורגשת בידית. אחת אינדיקציות כי הוואקום הוא עובד היא שבועות קטנות בערוץ ההיקפי ניתן לראות נעות באיטיות לכיוון מקור הוואקום. אינדיקציה נוספת היא כי coverslip תמיד צריך לנסוע עם השבב כאשר השבב הוא הרים מלמעלה (וזו השיטה המומלצת להובלה הקאמריתברגע שהזחלים הוא המיקום ואת הוואקום הוא על). הוואקום עלול להיות בסכנה אם יש סדקים בצינור, או אם יש נפט בצינור. זה יכול להיות מטופל בקלות על ידי החלפת 23 G מחלק קצה מחט וצינורות פוליאתילן-50 (מצעדים 1.6-1.14).
(2) בעלי החיים מת לאחר ההדמיה בשבב. ההליך זה נועד לגרום ללחץ מינימאלי על בעלי החיים, ויש להם חיות של גנוטיפ סוג בר שיעור הישרדות> 90%, גם לאחר שעות של חוסר תנועה על השבב 12. מאז כמה גנוטיפים עשויים להיות פחות גמישים ללחץ של השבב, יש לבדוק תחילה כי בעלי חיים מסוג בר (לדוגמא, קנטון S) לשרוד את טכניקת הקיבוע. א) הגורם השכיח ביותר לקטלני הוא מיקום לא נכון של הזחל (ראה איורים 2G-H). אם חלקים של הציפורן, הראש או קנה הנשימה הם לא לגמרי בתוך החדר, ואז הם יכולים להיות פגומים בחוסר התנועה, וזחל שהוא גדול מדי עבור השבב (> 4 מ"מ) הוא פחות סביר כדי לשרוד. ב) סיבה שכיחה פחות לקטלני היא השימוש בלחץ או ואקום בעת טעינת השבב יותר מדי. כשהוא מוצב כראוי בשבב, הלחץ שנוצר על ידי הוואקום הוא נסבל היטב. עם זאת לחץ מוגזם, או מהוואקום או בשלב הראשוני של מיצוב החיה יכול להיות בעיה. זה הכי טוב כדי ללמוד את מידת הלחץ הדרושה באופן אמפירי על ידי ניסויים עם זחלים מסוג בר בגודל הנכון. ג) אם יותר מדי שמן Halocarbon מכסה את קנה הנשימה של בעלי החיים בעלי החיים פוטנציאליים עלולים להיות בעיות בהישרדות לטווח ארוך. השמן ממלא מספר תפקידים חשובים בשבב: זה חשוב ליצירת הוואקום, אופטיקה במהלך הדמיה, וזה מנטרל יובש בשבב. יש להימנע משמן זאת מוגזם. (זה גם יכול להוביל לנפט בצינור והמזרק, להתפשר הוואקום). מעילי הפרוטוקול הציעו רק את הצד הגחוני של הזחל עם שמן, ולאחר מכן removes עודפי שמן על ידי מיקום של הזחל על coverslip נקי לפני העברה לcoverslip הסופי להדמיה. ד) phototoxicity ניתן לחוות מפגישת ההדמיה. כמו עם כל יישום הדמיה לחיות, הוא אידיאלי לשימוש זמני חשיפה קצרים עם אור נמוך עוצמת לייזר, אשר הוא הטובה ביותר להשיג באמצעות מצלמה או גלאי רגיש מאוד. נסה למזער את התאורה עם אור האולטרה סגול, כולל ספקטרום רחב אור שנוצר על ידי מקורות אור כספית.
נושאים אחרים וכיוונים לעתיד:
מאחר ושיטה זו לא לנצל הרדמה, לבו של בעל החיים ממשיך לפעום. זה יוצר כמה ניידות בלתי נמנעת, אשר משפיעה על הדמיה במקומות מסוימים יותר מאחרים. דוגמאות כאן מראות כי חוט עצב הגחון, עצבים מגזרי, וקיר גוף ניתן הדמיה בקלות ללא הפרעה מהלב. במקרים בהם קצב הלב משפיע הדמיה, לפעמים יכולות להיות מתוקנות תנועות הרגילות לעםבתוכנת ניתוח (לדוגמא, תוסף מייצב התמונה לImageJ). זה עובד היטב כאשר אובייקטים בודדים נעים על ציר זמן במהירות (לדוגמא ~ מיקרומטר / 1 שניות להובלת אקסון מהירה) או בקנה מידת זמן איטי מאוד (דקות עד שעות). עם זאת, כאשר האובייקט (ים) של מהלך עניינים עם מגוון רחב של מהירויות וכיוונים, זה יכול להיות קשה יותר לתיקון לתנועות הדופק מושרה.
בעיה נוספת היא השתנות קלה באופטיקה מבעלי החיים לבעלי חיים, או בין פגישות הדמיה מרובות של אותו בעלי החיים בשבב. העמוק יותר מושא העניין הוא בבעלי החיים, גדול יותר תהיה וריאציה זו. עצבים מגזריים וחוט עצב הגחון הם בדרך כלל עמוקה מדי בתוך אז חיה להיות צילמו במיקרוסקופ רגיל. עם זאת בלחץ המתון חווה בשבב הזחל דוחף את המבנים האלה קרובים מאוד לציפורן וcoverslip. המרחק המדויק של מבנים אלה מcoverslip יהיה וריאציות קטנות מTRIAL לדין. הווריאציה לאובייקטים לסגור את הציפורן, כגון גופי התא של הנוירונים חושיים, הוא פחות. לכן זה חשוב, במיוחד לביצוע מדידות של עוצמה, לנצל מספר רב של בעלי חיים ומחקרים עצמאיים לחשבון לשונות באופטיקה.
אמנם דוגמאות שהובאו כאן התמקדו על תהליכים בתוך תאי עצב, הגישה צריכה להיות נוחה להדמיה כל מבנה בבעלי החיים שניתן הביאו בתוך עומק ההתמקדות של מטרת מיקרוסקופ. זה כולל את הציפורן, קיר שרירי גוף, וNMJs. קנה הנשימה בצד הגחון של בעלי החיים ואפשרות חלקים של מערכת העיכול יכולים גם להיות צילמו. בעלי החיים יכולים גם להיות ממוקמים בצד הגב שלה לכיוון coverslip להדמיה לטווח קצר של מבנים סמוכים לפני השטח הגבי. יכולת מבני תמונה עמוקה בתוך בעלי החיים היא מוגבלת על ידי מרחק העבודה של מיקרוסקופ מטרת שימוש. מבנים כגון imדיסקי aginal אינם נגישים להגדלה גבוהה (למשל 40X) מטרות.
שבבי הזחל שתוארו בפרוטוקול זה מיועדים לזחלים בשלב מוקדם 3 instar rd (הנע בגודל 3.5-4 מ"מ). עם זאת הרבה שאלות מעניינות דורשות הדמיה בשלבי זחל שונים. שבבים קטנים יותר כדי להכיל 2 זחלי instar nd, או שבבים גדולים יותר כדי להכיל instars 3 rd מאוחר יכולים להיות מתוכננים בקלות באמצעות אותו העיקרון. (איור משלים 1 מכיל קובץ DXF לשינוי בקלות לייצור תבניות סיליקון עם גדלים קאמריים שונים). העיקרון הפשוט של החותם הפיך אפילו יכול להיות מיושם על אורגניזמים אחרים כגון ג elegans או דג הזברה, עם הגרסה העיקרית היא גודל החדר. כיוון עתידי שימושי הוא לעצב שבבים שיכולים לשתק את בעלי חיים רבים בו זמנית, לשימוש למטרות הקרנה. עם זאת, עבור זה, העיצוב היה צריך להיות שונה באופן משמעותימהמכשיר הנוכחי, שבו הסוגיות של מיצוב בעלי החיים בשבב צריך להיות עסקה עבור כל חיה באופן עצמאי.
Assay למחוץ העצב ללימוד תגובות פגיעה בעצבים היקפיים זחל:
Assay למחוץ עצב המתואר כאן לעצבים מגזרי זחל הוא שיטה פשוטה להחדרת פגיעה באקסונים היקפיים בדרוזופילה. יתרונות של שיטה זו כוללים: א) זה פשוט לנהל עם תקן כלים שנמצאו במעבדה דרוזופילה (CO 2 מקור סטראו ומלקחיים), ב) שהוא יכול להתנהל במהירות לבעלי חיים רבים, מה שהופך את הניתוח ביוכימי של חוטי עצב לאחר פגיעה 14 ריאלי; ג) התגובות מולקולריות ותאיות לפגיעה זו הן לשחזור 14,15,28 מאוד וניתן להשתמש בו כדי לגלות את התהליכים שהם גם חשובים בנוירונים חוליות 29,30.
שיטות חלופי לפציעתם של הנוירונים היא focusa לייזר בעצמה גבוהה, למשל פעמו-UV או לייזר femtosecond, לנתק את האקסון באמצעות מייקרו לייזר 17,31-33. שבב הזחל הוא שיטה אידיאלית למיצוב החיה למייקרו מסוג זה. עם זאת, בגלל הבדלים קלים באופטיקה בין ניסויים, שנדונה לעיל, השיטה מבוססת הלייזר יכולה להיות קשה יותר להתרבות בזחלים, בעיקר בעצבים מגזרי זחל. כמו כן, פגיעה באקסון לייזר מבוססת דורשת זמן רב יותר כדי למקם את כל בעלי חיים, ולכן קשה יותר לנהל בקנה מידה גדול (עם מספר גדול של בעלי חיים).
פתרון בעיות:
הבעיה הטכנית הנפוצה ביותר נתקלה מלמחוץ העצב היא מוות כתוצאה מנזק לאיברים פנימיים. בעת ביצוע למעוך, חשוב שלא לצבוט את חוט עצב הגחון, בלוטות רוק, או במעיים. כמו כן, חשוב שלא לנקב את העור המת. נושאים אלה נמנעו הטובה ביותר על ידי הבאת המלקחיים בזווית של ° 45 לsurfac הציפורןדואר (ראה איור 3).
יש האיכות של המלקחיים השפעה גדולה על האפקטיביות של ההתאהבות וההישרדות לאחר מכן. אנו ממליצים מספר Dumostar 5 מלקחיים. כדי לשמור על החדות שלהם, המלקחיים חייבים להיות מטופלים בזהירות, שאינו משמשים למטרות אחרות, והוחלפו ברגע שהם הופכים לבוטים או כפופים.
גודלו של בעל החיים יכול גם להשפיע על האפקטיביות של ההתאהבות. חיות קטנות (פחות מ 3 מ"מ אורך) הן הרבה פחות סיכוי לשרוד את הפציעה. עם בעלי חיים גדולים, (נדודי 3 instars rd), קשה יותר לאתר את העצבים ולמנוע נזק לבלוטות הרוק הגדולים והמעיים, ויש פחות זמן ללמוד את תגובות פציעה לפני ההתגלמות. למחוץ העצב מתנהל בצורה היעילה ביותר בזחלי instar 3 rd המוקדמים (שהם ~ 3-4.5 מ"מ האורך לאורך ציר anteroposterior).
מקור המזון שבעלי החיים עולה על עשוי להשפיע עלחוזקו של העור המת וההישרדות לאחר למחוץ. מומלץ לגדל בעלי חיים במזון עשויים ממתכון השמרים-גלוקוז סטנדרטי.
השיטה הטובה ביותר ללימוד איך לעשות למחוץ בצורה יעילה היא להתאמן על בעלי חיים רבים, תחילה במטרה העיקרית להשגת הישרדות (ולא התגלמות) 24 שעות לאחר למחוץ. בדרך כלל יש למתחילים שיעור נמוך הישרדות (למשל 10%), אבל ברגע שהטכניקה נלמדת, שיעורי הישרדות יכולים להגיע ~ 90%.
נושאים אחרים וכיוונים לעתיד:
Assay למחוץ מספק שיטה רבת עוצמה כדי לחקור הנביטה הפרוקסימלי האקסון לאתר פציעה והניוון של אקסונים וסינפסות דיסטלי לאתר פציעה. בעוד השיעורים של ניוון להשתנות בין סוגים שונים של תאי עצב, הם מאוד לשחזור בתוך סוג נוירון נתון, מתן עדות לשחזור של assay הפציעה.
לעומת זאת, 'משובי' הנבטההתגובה שנצפתה באקסונים הפרוקסימלי היא יותר מאתגר למחקר. כל האקסונים בעצב המגזרי ליזום נרחבים הנבטה קרובה לפגיעה באתר (לדוגמא, ראו איור 6 ואיור 3). עם זאת היקף ההנבטה יכול להשתנות מתא העצב לתא עצב, וקשה לכמת. מידה דומה ושונה בהנבטה ניתן לצפות לאחר יותר נגעי מוקד של motoneurons הבודד בעצבים מגזרי הציג באמצעות לייזר צבע פעמו UV. אנו מפרשים שיווני nondiscriminate של ההנבטה היא בשל היעדר רמזי הדרכה בעצבים המגזרי. לעומת זאת, אקסונים תא עצב תחושתיים נפגעו על ידי לייזר קרוב לגופי התא שלהם לעבור צמיחת אקסון חדשה באותו הכיוון כמו האקסון לאיבוד 34. האקסונים באזור זה של בעלי החיים סביר להניח שנחשפו למידע positional ספציפי יותר להדרכתו של אקסונים ההתחדשות. הסביבה בתוך עצבים מגזרי לא סביר שיש להם הרבה resemblanלסה"נ לסביבה שהאקסונים לנווט במקור בהדרכה שלהם בעובר, ולכן הוא לא צפוי להיות מידע כדי להדריך אקסונים התחדשות.
מגבלה נוספת ללימוד התחדשות באמצעות assay למחוץ עצב המגזרי היא שעדיין יש אקסונים חושיים וmotoneuron פצועים מרחק משמעותי כדי לכסות (.25-1 מ"מ) כדי להגיע ליעד שלהם, ומסגרת זמן מוגבלת (<3 ימים) לפני שעובר על בעלי החיים התגלמות. מחקר שנערך לאחרונה זיהה מניפולציה גנטית של קולטן הורמון prothoraciotropic שמשלש את משך הזמן של שלב זחל instar 3 rd 35. מניפולציה זו תרחיב את מסגרת הזמן ללימוד ההתאוששות והניוון של תאי עצב לאחר פגיעה באופן משמעותי, עד 9 במקום 3 ימים. זה עשוי להיות ארוך מספיק כדי להתבונן אירועים חדשים, כגון חיבור מחדש של האקסון נפגע עם יעד postsynaptic, במיוחד אם הפגיעה הנגרמת קרובה לסיום הסינפטי.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע, (מספר מענק IOS-0,842,701 לCAC), והמכון הלאומי לבריאות (R00MH080599 לBY, R21 NS062313 לNC, וNS069844 לCAC). ברצוננו להודות ג'יימס Schutt, אמילי האן, והלנים Truong לתמיכה טכנית, ומרכז מלאי Bloomington לקווים לטוס. כל השבבים היו מפוברק במתקן לוריא Nanofabrication באוניברסיטת מישיגן.
0.5 mm Polyethylene tubing | Fisher scientific | 14-170-11B | Polyethylene tubing, I.D. = 0.023’’, O.D. = 0.038’’ |
1 mm Polyurethane tubing | Fisher scientific | BB521-63 | Polyurethane tubing, I.D. = 0.063’’, O.D. = 0.125’’ |
barb to barb connector | Bio Rad | 732-8300 | 0.8 mm barb to barb connector |
3-way stopcock valve | Bio Rad | 732-8104 | Screw on valve for the syringe |
Syringe (20 ml) | Fisher scientific | 14-817-33 | Screw on 20 ml syringe for generating vacuum |
Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A684 | Needle for outlet connection |
Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D., .8mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A679 | Needle for outlet connection |
Halocarbon oil | Sigma | H8898 | Halocarbon oil 700 |
Dumostar Number 5 Forceps | Roboz | RS-498 | For nerve crush |
PDMS Kit (Base and curing agent) | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear |
Glass Coverslips | Fisher scientific | 12-544-C | 24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective) |
Disposable Plastic Cup (9 oz.) | |||
Plastic coffee stirrer stick | |||
Razor Blade | |||
Grape juice agar plates | See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe |