Выделение корковых микроглии с сохранившимися иммунофенотипа и функциональности из мышиных новорожденных
Summary
Одним из ключей к успешной расследования микроглии биологии является сохранение микроглии immunofunction экс естественных условиях в процессе выделения из ткани ЦНС. Изоляция микроглии через ротационным качанием результатов в высокочистых и immunofunctional клеточных культурах по оценке флуоресцентных изображений, иммуноцитохимии и ELISA после активации микроглии с провоспалительных стимулов липополисахарида (ЛПС) и Пэм 3 ЦСК 4 (Пэм).
Abstract
Выделение микроглии из ткани ЦНС является мощным исследовательским инструментом используется для изучения микроглии биологию экс естественных. Настоящий способ подробно процедуру для изоляции микроглии из неонатальных мышиных коры с помощью механического перемешивания с роторной качалке. Эта изоляция микроглии метод дает очень чистые корковых микроглии, которые проявляют морфологические и функциональные характеристики, указывающие на покоящихся микроглии в нормальных, непатологических условиях в естественных условиях. Эта процедура также сохраняет микроглии иммунофенотип и биохимический функциональность как показали индукции морфологических изменений, ядерной транслокации р65 субъединицы NF-kB (p65) и секреции чертой провоспалительных цитокинов, фактор некроза опухоли-α (ФНО-α ), на липополисахарида (ЛПС) и Пэм 3 ЦСК 4 (Пэм) проблемы. Таким образом, настоящее процедура изоляции сохраняет иммунофенотип обоих покоя и мероприятияотключенной микроглии, обеспечивая экспериментальный метод исследования микроглии биологию в бывших естественных условиях условиях.
Introduction
Клетки микроглии, макрофаги наблюдения паренхимы ЦНС, составляют около 12% от общего клеточной популяции взрослого мозга млекопитающих. Микроглия выводятся из желточного мешка миелоидных клеток-предшественников и различаются по плотности клеток и морфологии в различных cytoarchitectural регионов в взрослой ЦНС 1-5. В здоровом взрослом мозге, микроглии небольшие, разветвленные или полярные клетки с мелкими, динамических процессов. В отличие от периферической макрофагов морфологии, микроглии продемонстрировать покоя, низкопрофильный фенотип у здоровых мозгов, которые могут появиться как сотовый бездействия, однако в естественных условиях исследования изображений показывают, что микроглии процессы динамически расширить и убрать для контроля за их микросреду таким образом, напоминает " отбор проб и геодезия "6,7.
Микроглия высоко и дифференциально реагировать на окружающую среду и патофизиологических изменений в головном мозге, переключениеот Surveillant к государственным обычно рассматривается как их покоя и активированного государств эффекторных соответственно. Этот переключатель в активации может быть опосредованы рецепторами зацепления мембраносвязанных распознавания образов (PRRS), такие как платные-подобных рецепторов (TLR,), которые реагируют на патоген-ассоциированных молекулярных структур (PAMPs), а именно бактериальных и вирусных-производных липопротеинов , нуклеиновые кислоты, углеводы и 8-11. В дополнение к PAMPs, РРСС, также было показано, чтобы вызвать активации микроглии против стерильных непатогенных молекул, известных как опасность / повреждения связанных молекулярных моделей (DAMPS), которые представляют собой возмущение в ЦНС гомеостаза, таких как повреждение клеток 12-16. После включения РРСС инициировать внутриклеточных каскад, который приводит к изменениям в микроглии морфологии клеток и генной экспрессии сигнализации, а именно, активированной микроглии адаптировать фенотип амебоидной-как, перемещать р65 NF-kB субъединицы (P65) в ядро клетки, и активируют произвоводств и секреция провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-α (ФНО-α), интерлейкин-1 β (IL-1β), наряду с активными формами кислорода (АФК) 16-24. Хотя интеграл в врожденного иммунного ответа ЦНС, эти выделяемые молекулы также было обнаружено увеличение нейронов окислительный стресс, тем самым вызывая и обостряя нейродегенерацию в пораженных государств, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера 25-29.
Тем не менее, механизмы активации микроглии в патологических состояний полностью не выяснены. Таким образом, изоляция микроглии является мощным исследовательским инструментом в этих биологических процессов, так как многие в естественных особенностей активации микроглии может быть обобщены в культуре. Существует несколько методов для выделения микроглии, в том числе изоляции через градиентом Перколла следующие ферментативного переваривания ткани ЦНС 30,31. Тем не менее, ферментативное расщепление может изменитьиммунофенотип клеток путем снижения клеточной поверхности антиген выражение 32, и приводит к снижению выхода клеток на животное, чем методом, описанным в данном документе. В частности, мы сообщаем средний урожай микроглии за щенка коры 7,5 х 10 5 клеток, в то время как ранее сообщалось методы изоляции от всей ЦНС через Перколла градиента доходности 3-5 × 10 5 клеток 30,33,34. Настоящая процедура обходит использование пищеварения ферментов по изоляции микроглии на основе их свойств низкой приверженности, тем самым сохраняя микроглии иммунофенотип и функциональность.
В настоящем исследовании мы описывают выделение клеток микроглии из смешанных глиальных культурах, полученных из новорожденных гетерозиготных CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -), и C57BL / 6 мышей коры через механическим перемешиванием на роторной качалке, расширение ранее опубликовал метод 24,35. Мы используем бывшего напряжение мыши для легкой визуализации микроглии, какэти мыши выразить GFP под контролем эндогенного локуса CX3CR1 – моноцитов-специфического промотора 36-38. Этот метод дает очень чистые микроглии культурами в консервированных иммунофенотипа исключая виво, как показано на морфологических изменений, ядерной транслокации р65 и секреции TNF-α, когда вызов с бактериальным липополисахаридом (ЛПС) или Pam 3 CSK 4, TLR4 и TLR1 / 2 агонистов , соответственно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящая процедура предлагает эффективный способ выделения корковых микроглии от новорожденных мышей. Эта процедура имеет двукратное преимущество 1) сохранение микроглии иммунофенотипа и функциональности, как это определено флуоресцентных изображений, иммуноцитохимии и ELISA, и 2) чт…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIEHS R01ES014470 (КМЗ).
Materials
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 inch; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of specific equipment | |||
| Name of Equipment | Name of Company | Catalogue Number | Comments |
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. 신경과학. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia.. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson’s Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson’s disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson’s disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer’s disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
