Overvåge ændringer i Membrane polaritet, Membrane Integritet, og intracellulære Ion Koncentrationerne i<em> Streptococcus pneumoniae</em> Brug fluorescerende farvestoffer

Summary

I modsætning til det, der ses for eukaryoter, er der en mangel på undersøgelser, der detaljeret membrandepolarisering og ionkoncentration ændringer i bakterier, primært som deres lille størrelse gør konventionelle målemetoder vanskelig. Her har vi detalje protokoller for overvågning af sådanne begivenheder i den betydelige Gram-positive patogen Streptococcus pneumoniae udnytte fluorescens teknikker.

Abstract

Membrandepolarisering og ionstrømme er begivenheder, der i vid udstrækning er blevet undersøgt i biologiske systemer på grund af deres evne til at dybt påvirke cellulære funktioner, herunder energetics og signal transduktioner. Mens både fluorescerende og elektrofysiologiske metoder, herunder elektrode brug og patch-fastspænding, er blevet godt udviklet til måling af disse begivenheder i eukaryote celler, har metode til måling af lignende hændelser i mikroorganismer vist sig mere udfordrende at udvikle på grund af deres lille størrelse i kombination med mere komplekse ydre overflade af bakterier afskærmning membranen. Under vores studier af død-indvielse i Streptococcus pneumoniae (pneumokokker), ønskede vi at belyse den rolle membran begivenheder, herunder ændringer i polaritet, integritet og intracellulære ion koncentrationer. Søgning litteraturen fandt vi, at der findes meget få undersøgelser. Andre forskere havde overvåget radioisotop optagelse eller ligevægt til at måle ion influenzaxes og membran potentiale og et begrænset antal undersøgelser, primært i Gram-negative organismer, havde set nogle succes ved hjælp carbocyanine eller oxonol fluorescerende farvestoffer til at måle membran potentiale, eller lastning bakterier med celle-permeant acetoxymethyl (AM) ester versioner af ion-følsomme fluorescerende indikatorfarvestoffer. Vi har derfor etableret og optimeret protokoller til måling membran potentiale, sprænges og ion-transport i grampositive organisme S. pneumoniae. Vi har udviklet protokoller ved hjælp af bis-oxonol farvestof DiBAC ₄ (3) og den celle-impermeabel farvestof propidiumiodid at måle membrandepolarisering og brud henholdsvis samt metoder optimalt at indlæse pneumokokker med AM estere af ratiometrisk farvestoffer Fura-2, PBFI og BCECF at detektere ændringer i intracellulære koncentrationer af ^{Ca2 +,} K ⁺ og H ^+, henholdsvis ved hjælp af en fluorescens-påvisning pladelæser. Disse protokoller er de første af deres art for pneumokokkerog de fleste af disse farvestoffer ikke har været anvendt i andre bakteriearter. Selvom vores protokoller er blevet optimeret til S. pneumoniae, vi mener, at disse tiltag skal danne en glimrende udgangspunkt for lignende undersøgelser i andre bakteriearter.

Introduction

Vores laboratorium har identificeret et protein-lipid-kompleks fra human mælk opkaldt HAMLET (for Human Alpha-lactalbumin Made livsfarlige Tumorceller), som inducerer apoptose i tumorceller, men er også i stand til at dræbe en lang række bakteriearter ^1,2. De arter, der blev anset for at være særligt følsomme, var dem, der er målrettet luftvejene, med Streptococcus pneumoniae (den pneumokokker) viser den største følsomhed og en apoptose-lignende fænotype dødens ^2,3. Membrandepolarisering og specifik ion transporter er velbeskrevet og afgørende begivenheder i apoptose i eukaryote celler, især i mitokondrierne, hvor radioaktive TPP ^+-ioner og fluorescerende farvestoffer, herunder JC-1 og TMRE er blevet anvendt til at påvise depolarisering af mitokondriemembranen ^{3 -5.} Således har vi forsøgt at lære mere om effekten af ​​HAMLET på disse membran-relaterede funktioner i pneumokokker, som vi fokuseret vores indsats påudvikle en bedre forståelse af de mekanistiske komponenter i apoptose-lignende fænotype i bakterier, med et stort potentiale for at identificere nye antibakterielle behandlinger eller vaccinekandidater i processen.

I bestræbelserne på at udarbejde protokoller for vores mekanistiske undersøgelser, opdagede vi, at i modsætning til det velbeskrevne metode i eukaryote systemer, der er meget få offentliggjorte undersøgelser beskriver elektrofysiologi og ion transport mekanismer bakteriemembranen ^6,7. Dette er primært tilskrives den mindre størrelse af mikroorganismer og deres overflade arkitektur, især tilstedeværelsen af ​​cellevæggen, der begrænser adgangen til membran til anvendelsen af ​​konventionelle eukaryote metoder som patch fastspænding, selv om nogle undersøgelser ved hjælp af gigantiske protoplaster er blevet udført med blandet succes ^8,9. Efterhånden som arbejdet med disse gigantiske protoplaster er ikke en ideel eller endog praktisk metode for de fleste bakterielle arter, da det kræver mandipulated bakterier i en unaturlig og abiotisk tilstand, har de begrænsede undersøgelser af bakteriemembran polaritet der er blevet udført primært beskæftiget flowcytometri og brugen af cyanine og oxonol fluorescerende farvestoffer ^10-16.

I stedet for flowcytometri, som samler de enkelte fluorescensaflæsninger fra en bakterie på et enkelt tidspunkt, valgte vi at anvende en fluorescenspåvisning pladelæser at detektere fluorescens intensitet af bakterielle suspensioner i en 96-brønds plade-format over tid. Dette gjorde det muligt at behandle en population af bakterier på forskellige tidspunkter med meget større enkelhed og lethed, og løbende overvågning af fluorescens kinetik af hele befolkningen i længere tid, hvilket er vanskeligt at opnå ved anvendelse af flowcytometri. Efter at have testet en lang række af de potentielle følsomme fluorescerende farvestoffer (herunder de ovenfor nævnte til brug med mitokondrier), opnåede vi det bedste tekniske og praktiske succes ved hjælp afbis-oxonol farvestof kaldet DiBAC ₄ (3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric syre) trimethine oxonol) for at overvåge ændringer i polaritet.

Vi har også fundet det værdifuldt at samtidig overvåge forstyrrelser i integriteten af ​​membranen ved hjælp af propidiumiodid (PI). Dette farvestof fluorescerer efter binding til nukleinsyre, men er kun i stand til at gøre det, når integriteten af ​​den bakterielle membran er kompromitteret, hvilket gør det til det populære komponent, der anvendes til at påvise døde celler i levende-døde farvningsmetoder analyser. Ud over PI, SYTOX grøn og TO-PRO-1 er fluorescerende farver, der ligner i aktion og har tidligere været anvendt til bakterier i nogle undersøgelser ved hjælp af flowcytometri påvisningsmetoder ^17. Vi valgte at bruge PI grund af sin excitation bølgelængde, der gav os mulighed for at overvåge fluorescens samtidig med DiBAC i en given prøve.

I vores undersøgelser har vi observeret, at HAMLET, såvel som et andet beslægtet protein-lipid-kompleks med baktericid aktivitetkendt som ELOA inducerede depolarisering og brud af den bakterielle membran som angivet ved stigninger i fluorescensen af begge farvestoffer ved behandling af pneumokokker ^3,18,26. For begge komplekser, observerede vi, at fluorescensintensiteten af DiBAC ₄ (3) forøget forud for forøgelse af intensiteten af PI, hvilket indikerer, at depolarisering fundet sted forud for brud og er derfor en specifik hændelse induceret af vores baktericide protein-lipid-komplekser af interesse. Denne sondring er vigtig at gøre, som brud på membranen selv kan forårsage uspecifik depolarisering. Måling og analyse af både DiBAC ₄ (3) og PI fluorescens kinetik samtidig tilladt os at undersøge dette forhold mellem de to membran begivenheder, hvilket er en yderligere fordel ved at bruge fluorometri stedet for flowcytometri.

At overvåge bakteriel ion flux, har der været nogle tidligere succes med at bruge radioisotoper, herunder måle optagelse af45 Ca ^{2 +} i pneumokokker ^19,20, som vi også har brugt i vores seneste undersøgelser ^{18, 21.} Men, der arbejder med disse radioaktive ioner har flere ulemper. De kan være dyrt, tidskrævende og rodet, og kan også udsætte den enkelte udfører eksperimentet til skade, afhængigt af isotop af interesse. Desuden er det vanskeligt at overvåge hurtige ændringer over tid. Således har vi vendt mod en alternativ målemetode, der beskæftiger acetoxymethyl (AM) ester versioner af ion-følsomme fluorescerende indikator farvestoffer. I sig selv er indikatorfarvestoffet opladet og ikke passere gennem membranen let, men med tilsætning af den lipofile estergruppe, kan nu uladet molekyle passere gennem membranen af ​​bakterien. Ved ankomsten det indre, de bakterielle esteraser spalter estergruppen efterlod farvestof fri inde i cellen og sigtet igen betydeligt langsommere dens evne til at forlade cellen og tillade farvestoffet to ophobes inde over tid. Imidlertid har brugen af disse ester farvestoffer kun været beskrevet i nogle få bakteriearter at konstatere ændringer i intracellulær Ca ^{2 + 22-24} og H ^{+ 16,} med varierende metoder til lastning, afsløring og succes.

Med et ønske om at overvåge ændringer i intracellulær Ca ^{2 +} og også K ⁺ og H ⁺ niveauer i S. pneumoniae ved behandling med HAMLET og andre forbindelser, vi med succes skabt protokoller til effektivt at indlæse fluorescerende indikatorfarvestoffer i bakterieceller. Effektiv læsning ind i bakterier, der kræves både probenecid, der øger farvestof fastholdelse ved at blokere anion-transportører og kraftladning, en proprietær forbindelse fra Life Technologies, der øger læsning effektivitet. Fura-2/AM (påvisning af Ca ^{2 +),} PBFI / AM (påvisning af K ^+), og BCECF / AM (påvisning af H ⁺⁾ blev indlæst i både uindkapslet og indkapslet pneumokok stregnskyl muliggør måling af de resulterende fluorescens mønstre efter tilsætning af ionoforer, såsom ionomycin (Ca ^{2 +} afkobler), valinomycin (K ⁺ afkobler) og CCCP (H ⁺ afkobler) med en fluorescenspåvisning pladelæser ^{18, 21.}

Protocol

1.. Forberedelse bakteriekulturer Voksende kultur til anvendelse i eksperimenter I en 37 ° C varmeblok, optø en frossen lager hætteglas S. pneumoniae og tilføjer dens indhold til 9 ml frisk, foropvarmet Todd-Hewitt-bouillon med 0,5% gærekstrakt (THY) til et samlet volumen på 10 ml i et glas kultur rør. Inkuberes statisk ved 37 ° C, indtil kulturen når mid-log-fase (Abs 600 nm ≈ 0,5-0,6). 2. Afsløring…

Representative Results

For alle eksperimenter er der en prøve og sæt betingelser er til stede i hver brønd. De enkelte sporing repræsenterer fluorescensintensitet af en hel population af bakterier over tid. Resultaterne skal være let fortolkelige, med en klar skelnen mellem fluorescensen af ​​de behandlede prøver og at af de ubehandlede kontroller. Kinetik og graden af ​​en observeret ændring i fluorescens kunne give oplysninger om mulig mekanisme og omfanget af den begivenhed, der overvåges. <p class="jove_conten…

Discussion

På trods af den begrænsning, at størrelsen præsenterer for brug af klassiske elektrofysiologi metoder til at detektere ændringer i polaritet og integriteten af membranen og ændringer i ion-koncentrationer inden bakterier, har vi beskrevet en måde at måle disse hændelser i S. pneumoniae anvendelse af fluorescerende farvestoffer. Vores protokoller er det første af sin art beskrevet for pneumokokker og en af ​​de få beskrevet for bakteriearter i almindelighed. Ved hjælp af en fluorescenspåvisning …

Materials

Todd Hewitt	Bacto, BD Diagnostics	249240
Yeast Extract	Bacto, BD Diagnostics	212750
Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)	Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	DMSO
DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)	Molecular Probes	B-438
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Make up in deionized water
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich
PowerLoad	Molecular Probes	P10020	100X concentrate
Probenecid	Molecular Probes	P36400	Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial
Fura-2/AM	Molecular Probes	F1221	Special packaging (50 µg aliquots)
PBFI/AM	Molecular Probes	P1267	Special packaging (50 µg aliquots)
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143
KH2PO4	JT Baker	3246-01	monobasic
K2HPO4	JT Baker	4012-01	dibasic
NaOH	JT Baker	5565-01
BCECF/AM	Molecular Probes	B1170	Special packaging (50 µg aliquots)
CCCP	Sigma-Aldrich		Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,
			dissipating the electrical potential and the H+ gradient.
Culture tube	VWR	53283-802	Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass
Spectrophotometer	Thermo Scientific		Spectronic 20D+
15 ml plastic conical tube	Corning	430790
Clear 96-well polystyrene microtiter plate	Fisher Scientific	12-565-501
Plate reader	BioTek	Synergy 2 Multi-Mode
		Microplate Reader
Gen5 software	BioTek	Gen5™ Software