Utarbeidelse av Hydroxy-PAAM Hydrogeler for frakobling effekten av Mechanotransduction Cues
Summary
Vi presenterer en ny polyakrylamid hydrogel, kalt hydroxy-PAAM, som gjør at en direkte binding av ECM proteiner med minimal kostnad eller ekspertise. Kombinasjonen av hydroxy-PAAM hydrogeler med microcontact utskrift forenkler uavhengig kontroll av mange signaler av den naturlige cellemikromiljøet for å studere cellulære mechanostransduction.
Abstract
Det er nå godt etablert at mange cellulære funksjoner er regulert av interaksjoner av celler med fysio og mekaniske signaler av deres ekstracellulære matrise (ECM) miljø. Eukaryote celler stadig forstand deres lokale mikromiljøet gjennom overflate mechanosensors å transduce fysiske endringer av ECM i biokjemiske signaler, og integrere disse signalene for å oppnå konkrete endringer i genuttrykk. Det er interessant å fysiokjemiske og mekaniske parametere for ECM kan par med hverandre for å regulere celle skjebne. Derfor er en nøkkel til å forstå mechanotransduction å kople den relative bidraget av ECM signaler om cellulære funksjoner.
Her presenterer vi en detaljert forsøksprotokoll for å raskt og enkelt generere biologisk relevante hydrogeler for den uavhengige tuning av mechanotransduction signaler in vitro. Vi kjemisk modifiserte polyakrylamidprodukter hydrogeler (PAAM) til å overvinne sine egen ikke-adhesive egenskaper ved å innlemme hydroksyl-funksjonalisert akrylamidmonomere under polymeriseringen. Vi har oppnådd en ny PAAM hydrogel, kalt hydroksy-PAAM, som tillater immobilisering av en hvilken som helst ønsket art av ECM-proteiner. Kombinasjonen av hydroksy-PAAM hydrogeler med microcontact utskrift gjør det mulig å uavhengig styre morfologien av enkelt-celler, matrisen stivhet, arten og tettheten av ECM-proteiner. Vi tilbyr en enkel og rask metode som kan settes opp i hver biologi lab for å studere in vitro celle mechanotransduction prosesser. Vi validere denne nye todimensjonal plattform ved å utføre eksperimenter på endoteliale celler som utviser en mekanisk kopling mellom ECM stivhet og kjernen.
Introduction
Mange sider ved den lokale cellulære mikromiljø (for eksempel, stivhet, porestørrelse, arten av proteiner, eller celle-tettheten ligand) gir et koordinatsett av regulatoriske signaler som styrer cellulære prosesser som motilitet, celleproliferasjon, differensiering og genekspresjon. Modifikasjoner av de fysiokjemiske egenskapene til det ekstracellulære miljø kan oppfattes av celler og forårsake forskjellige fysiologiske konsekvenser, herunder deformasjon av cellepolarisering, migrering og differensiering. Det er fortsatt uklart, men hvordan celler sette ECM modifikasjoner i cellulære biokjemiske signaler. Det er derfor av stor betydning for ingeniør kontrollert in vitro microenvironments som kan reprodusere samspillet mellom celler og deres mikromiljø for å studere mechanotransduction trasé. For å løse dette problemet, har vi nylig innført en ny metode 1, kalt hydroxy-PAAM hydrogeler, å enkelt generere to-kronensional myke matriser som tillater å selvstendig styre viktige mechanotransduction pekepinner: matrix stivhet, cellegeometri og nedkomst, natur av proteinet og celle-ligand tetthet.
ECM dirigerer cellulære prosesser via gradienter i morphogens (kjemotaksis), selvklebende proteiner (haptotaxis) og stivhet (durotaxis). I løpet av de siste tiårene, avansert in vitro plattformer har blitt utviklet for å isolere disse ekstracellulære signaler for å erte ut hvordan cellene er i stand til å oversette biokjemiske og biofysiske funksjoner i fysiologiske prosesser 2-5. Elektron-strålen 6, fotolitografi 7, fotokjemisk immobilisering 8, eller plasma-assistert 9 teknikker har blitt utviklet for å styre veksten av levende celler på micropatterned substrater. Selv om disse teknikkene har gitt viktige resultater, de fleste av dem ikke tillate diskriminering mellom den enkelte påvirkning av forskjellige signaler på celle atferdog de krever tekniske anlegg som få laboratorier kan ha råd til. Blant disse teknikkene, microcontact utskrift (μCP), har dukket opp som en robust og tilgjengelig metode for å skape celle-klebende mikro øyene 10. Flere nylig, omfattende arbeid 11-14 har blitt gjort for å utvikle μCP på hydrogeler med tunbare stivheter for å reprodusere det brede spekter av stivheter observert i levende vev. Blant disse arbeidene har polyakrylamid (PAAM) blitt populært 15 og er allerede en av de mest brukte polymerbaserte matriser for celle Biomekanikk analyser.
PAAM overflater blir ofte funksjonalisert med heterobifunksjonell tverrbinder N-sulfosuccinimidyl-6-[4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) og ECM-proteiner er knyttet til overflaten av UV-aktivering av sulfo-SANPAH nitrofenyl Azide grupper 16. En annen teknikk består i koblings hydrazin for proteiner som er sterkt oksydertmed perjodat 17. Hynd og kollegaer innført en teknikk for patterning biomimetic hydrogel overflater med protein og peptider som krever fotopolymerisasjon i nærvær av en acroyl-streptavidin monomer 18. Mer nylig, Tseng et al. Har rapportert om en ny metode micropatterning 19 basert på UV eksponering av PAAM gjennom en optisk kvarts maske som trenger å inkubere aktiverte PA geler med 1-etyl-3-[3-dimetylamino-propyl] karbodiimid-hydroklorid (EDC) og N-hydroksysuksinimid (NHS) vannoppløsninger før legge proteinet. Til tross for muligheten av disse teknikker for å skape homogene og reproduserbare proteiner micropatterns, de fleste av dem lider av store begrensninger: lang synteseprosesser (for eksempel dialyse, lyofilisering, etc), dyre kjemiske forbindelser (f.eks hyaluronsyre, sulfo-SANPAH) eller fjerne ultrafiolette bestråling. I tillegg trenger disse teknikkene ikke tillate uavhengige modulering av underlaget stivhet, micropatterngeometri, ECM-proteinnatur, og celle-ligand tetthet.
Tar disse begrensningene i betraktning, har vi utviklet en ny og enkel akrylamid basert tilnærming som gjør at immobilisering av en rekke proteiner og biomolekyler på myke hydrogel og tillater uavhengig tuning av mechanotransduction pekepinner for å dechiffrere deres rolle på cellulære funksjoner. I stedet for å behandle PAAM hydrogeler med sterke kjemiske forbindelser, innfører vi en kommersiell akrylamidmonomer med hydroksylgrupper under PAAM polymerisasjon. Denne enkle operasjonen overvinner den iboende anti-klebende eiendom PAAM hydrogel uten andre tekniske krav.
Tilstedeværelsen av hydroksylgrupper fører til en høy affinitet for hydroksy-PAAM hydrogeler for proteiner og biomolekyler som danner hydrogen-bindingsinteraksjoner. I kombinasjon med μCP, hydroxy-PAAM hydrogeler muliggjøre en rask generering av to-dimensjonale kultur plattform med en uavhengig kontrollpå matrise stivhet, type ECM proteiner, celle-ligand tetthet og begrenset klebrighet, som er tenkt å være en kraftig plattform for å studere mechanotransduction.
Hensikten med denne protokollen er å gi nødvendig informasjon for lett å lage hydroxy-PAAM hydrogeler uten kompetanse på materialvitenskap. Det ultimate målet er å gi et middel for forskere å spørre fysiologisk relevante spørsmål på cellenivå og vevsnivåer som kan føre til en bedre forståelse av mechanotransduction trasé involvert i patofysiologiske mekanismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mange in vitro observasjoner i moderne cellebiologi er utført på stive glassDekk, ofte belagt med et tynt lag av ECM proteiner eller syntetiske peptider som inneholder RGD-sekvensen. Men ikke slike grunnleggende kultur underlag ikke rekapitulere hele fysisk-kjemiske kompleksiteten i ECM og dermed ikke gi en nøyaktig modell for å studere cellulære mechanotransduction prosesser. For å takle dette problemet, foreslår vi en enkel alternativ til functionalize todimensjonale hydrogeler med ønsket beløp og na…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through “MIS Confocal Microscopy”, “Crédit aux Chercheurs” grants and the “Nanomotility FRFC project” (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and Géraldine Circelli for confocal imaging.
Materials
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0,2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1M in H20 | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| (rabbit) | |||
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| (rabbit) | |||
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
References
- Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
- Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking. Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).
- Atmanli, A., Domian, I. J. Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing. J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).
- Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays. Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).
- Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes. Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).
- Rundqvist, J., et al. High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation. J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).
- Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications. Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).
- Holden, M. A., Cremer, P. S. Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces. J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).
- Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture. Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol “ink” followed by chemical etching. Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).
- Tseng, Q., et al. New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS ONE. 7, e51499 (2012).
- Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli. Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Hemphill, M. A., et al. A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury. PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).
- Tseng, Q., et al. new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells. Nat. Commun. 3, 671 (2012).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus. Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).
- Trappman, B., Chen, C. S. How cells sense extracellular matrix stiffness: a material’s perspective. Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).
