Långsiktig Kronisk<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Airway infektion hos möss
Summary
Vi beskriver den agar-pärlor metod för att etablera ihållande långtids kronisk Pseudomonas aeruginosa luftvägsinfektion i musmodell.
Abstract
En musmodell av kronisk luftvägsinfektion är en viktig tillgång i cystisk fibros (CF) forskning, även om det finns ett antal frågor om själva modellen. Tidiga faser av inflammation och infektion har studerats i stor utsträckning med hjälp av Pseudomonas aeruginosa agar-pärlor musmodell, medan endast ett fåtal rapporter har fokuserat på den långsiktiga kronisk infektion in vivo. Den största utmaningen för långsiktig kronisk infektion förblir låga bakteriella bördan av P. aeruginosa och den låga procentandelen av infekterade möss veckor efter utmaning, vilket indikerar att bakterieceller progressivt rensas av värden.
Denna uppsats presenterar en metod för att erhålla en effektiv långsiktig kronisk infektion hos möss. Denna metod är baserad på inbäddning av P. aeruginosa kliniska stammar i agar-kulor in vitro, följt av intratrakeal instillation i C57Bl/6NCrl möss. Bilateral lunginfektion är förknippad med sevmänna mätbara avläsningar inklusive viktminskning, dödlighet, kronisk infektion, och inflammatorisk reaktion. The P. aeruginosa RP73 klinisk stam drogs över PAO1 referenslaboratorium stam eftersom det resulterade i en jämförelsevis lägre dödlighet, mer allvarliga skador, och senare kronisk infektion. P. aeruginosa kolonisering kan kvarstå i lungan i över tre månader. Murina lungpatologi påminner om CF-patienter med avancerad kronisk lungsjukdom.
Denna musmodell efterliknar närmast loppet av sjukdomar hos människan och kan användas både för studier av patogenes och för utvärdering av nya terapier.
Introduction
Cystisk fibros (CF) är en genetisk sjukdom som orsakas av mutationer i cystisk fibros transmembran-(CFTR)-genen. Denna gen kodar för en kloridkanal som uttrycks på membranet hos de flesta epitelceller. Bronkiektasi, slem pluggning och parenkymal förstörelse som orsakas främst av Pseudomonas aeruginosa infektioner successivt leda till allvarlig lungsjukdom och dödlighet i de flesta CF-patienter 1. Förstå CF patogenes och vidareutveckling av nya terapier beroende av djurmodell med karakteristiska dragen i CF. Flera möss, genetiskt modifierade för CFTR-genen, har genererats, men begränsningar i möjligheterna för dessa arter att rekapitulera CF-liknande lungsjukdom och flera andra avvikelser orgel ses i CF-patienter har väldokumenterat 2.
Utveckling av infektion är en av de stora utmaningarna i CF djurmodell. Litteratur cltidigt antyder att en kronisk infektion som varar mer än en månad kan endast uppnås om möss ympas med bakterier inbäddade i ett immobiliseringsmedel såsom agar, agaros, eller tång alginat 3-5. Dessa immobiliseringsmedel ge mikroaerob / anaeroba förhållanden som gör att bakterier att växa i form av mikrokolonier, på samma sätt som tillväxten i slem i CF-patienter 6. Denna modell av kronisk infektion leder till ihållande bakterier i lungorna som orsakar luftvägsinflammation och skada 7. Men beroende på vilken metod som används, den bakteriestam och dosen ympas i lungorna, kan andelen kroniskt infekterade möss och bakteriehalten återfanns i lungorna vid olika tidpunkter varierar avsevärt. I synnerhet den största utmaningen för långsiktig kronisk infektion förblir låga bakteriebördan av P. aeruginosa och den låga procentandelen av infekterade möss veckor efter utmaning, vilket indikerar that bakterieceller successivt rensas av värden. Genom att välja P. aeruginosa RP73 klinisk stam från en samling av CF isolerar 8 vi framgångsrikt fått låg dödlighet, mer allvarliga skador, och hög andel av kronisk infektion med en stabil bakteriehalten upp till en månad i C57Bl/6NCrl möss.
Detta dokument specificerar metoden för inbäddning P. aeruginosa i agar kulor, vi har infekterade möss med intratrakeal instillation, mätt bakteriehalten och cytokiner i lungorna, samlas BAL vätska och utfört histologisk undersökning. Sammantaget kommer detta protokoll hjälpa forskare att ta itu principiellt viktiga frågor om patogenes 8,9 och testa nya terapier mot P. aeruginosa kronisk infektion 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritiska stegen i P. aeruginosa-pärlor förberedelse och mus utmaning redovisas nedan.
The P. aeruginosa-stam som används för möss utmaning är kritisk. Dödlighet, kronisk infektion eller clearance kan skilja sig avsevärt beroende på vilken bakteriestam som används för utmaningen. The P. aeruginosa RP73 klinisk stam drogs över PAO1 referenslaboratorium stam eftersom det resulterade i en jämförelsevis lägre dödlighet, mer allvarliga skador, och sena…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Bragonzi laboratorium har finansierats av den italienska Cystisk Fibros Foundation (CFaCore) och EU-F7-2009 till 223.670. En del av detta arbete genomfördes i Alembic, en avancerad mikroskopi laboratorium, och mus histopatologi utfördes i enheten i patologisk anatomi (San Raffaele Scientific Institute).
Materials
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml syringe 25 G 5/8'' 0.5 x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22GA 0.9 x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% neutral buffered formalin | Bio-optica | 05-01005Q | |
| Harris haematoxylin non Papanicolau | Bio-optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-optica | 05-M11007 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366931(great) | |
| 2366925(small) | |||
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 |
References
- Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).
- Bragonzi, A. Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens. IJMM. 300, 584-593 (2010).
- Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G., Bass, J. A. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).
- Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia. Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).
- Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres. APMIS. 98, 203-211 (1990).
- Bragonzi, A., et al. Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model. J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).
- van Heeckeren, A. M. Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection. Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM. 180, 138-145 (2009).
- Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A., Filloux, S., Ramos, J. L. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. , (2014).
- Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 .
- Paroni, M. Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment. J. Infect. Dis. In press, .
- Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence.. AJRCCM. In press, (2009).
- Pirone, L., et al. Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains. Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).
- Bragonzi, A., et al. Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response. PLoS One. 7, .
- Bianconi, I., et al. Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection. PLoS Pathog.. 7, (2011).
