Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen
Summary
Deze video toont een eenvoudige en betrouwbare strategie voor de bereiding van zuivere kweken van endotheelcellen van embryonale voorhersenen binnen 10-12 dagen en zal nuttig zijn voor onderzoek zich op vele aspecten van cerebrale angiogenese.
Abstract
Embryonale hersenen endotheelcellen kan dienen als een belangrijk instrument in de studie van angiogenese en neurovasculaire ontwikkeling en interacties. De twee vasculaire netwerken van de embryonale voorhersenen, pial en periventriculaire, zijn ruimtelijk onderscheidend en hebben een verschillende herkomst en groeipatronen. Endotheliale cellen van de pial en periventriculaire vasculaire netwerken hebben unieke genexpressie profielen en functies. Hier geven we een stap-voor-stap protocol voor isolatie, cultuur en verificatie van zuivere populaties van endotheelcellen uit de periventriculaire vasculaire netwerk (PVECs) van de embryonale voorhersenen (grote hersenen). In deze benadering wordt telencephalon zonder pial membraan verkregen uit embryonale dag 15 muizen gehakt, gedigereerd met collagenase / dispase en mechanisch gedispergeerd in een enkele celsuspensie. PVECs worden gezuiverd van celsuspensie met behulp van positieve selectie met anti-CD-31/PECAM-1 antilichaam geconjugeerd aan microbolletjes met behulp van een sterk magnetischscheidingsmethode. Gezuiverde cellen worden gekweekt op collageen 1 gecoate cultuur gerechten in endotheelcellen kweekmedium totdat ze samenvloeiing en verder gesubkweekt. PVECs verkregen met dit protocol tentoonstelling kasseien en spil gevormd fenotypes, zoals gevisualiseerd door fase-contrast licht microscopie en fluorescentie microscopie. Zuiverheid van PVEC culturen werd opgericht met endotheelcellen markers. In onze handen, deze methode betrouwbaar en consistent levert zuivere populaties van PVECs. Dit protocol zal profiteren studies gericht op het verkrijgen van mechanistische inzichten in voorhersenen angiogenese, het begrijpen PVEC interacties, en cross-gesprekken met neuronale celtypes en heeft enorm potentieel voor therapeutische angiogenese.
Introduction
Angiogenese, neurogenese en neuronale migratie zijn kritieke gebeurtenissen in het centrale zenuwstelsel (CNS) ontwikkeling, herstel en regeneratie. Verschillende elegante studies hebben aangetoond dat endotheelcellen stimuleert neuronale proliferatie en vice versa door afgifte van oplosbare factoren en door direct contact. We vonden het merkwaardig dat in de meerderheid van deze studies 1-3, terwijl neuronale voorlopercellen / neurale stamcellen worden geïsoleerd uit de embryonale hersenen, worden ze gekweekt samen met endotheliale cellen van de volwassen hersenen, andere volwassen weefsel bronnen of endotheliale cellijnen. Dit kan gedeeltelijk te wijten zijn aan de technische moeilijkheden bij het isoleren en kweken van zuivere populaties van endotheelcellen van embryonale hersenen. Echter, angiogenese, neurogenese en neuronale migratie zijn gelijktijdige gebeurtenissen in ordes van grootte meer robuust in de embryonale hersenen dan in de normale volwassen hersenen. De periventriculaire vasculaire netwerk van de embryonic voorhersenen (grote hersenen) afkomstig uit een vat geplaatst in de basale ganglia primordium en ontwikkelt in de vorm van een ordelijke gradiënt van ventraal grote hersenen, rug van embryonale dag 11 (E11) 4,5. Deze plexus van schepen van de periventriculaire vasculaire netwerk zijn te onderscheiden van pial schepen op basis van afkomst, anatomische locatie, groeipatronen en ontwikkelingsregulatie 4,5. De richting van de voortplanting van de periventriculaire angiogenese verloop overeenkomt met de telencephalic dwarse neurogenetische verloop. Binnen de grote hersenen, de periventriculaire angiogenese gradiënt en het verloop van GABA neuronen migreren tangentiaal overlapt ruimtelijk en 6. Met betrekking tot de timing, de angiogenese gradiënt is op voorhand van de neurogenetische gradiënt en GABA neuron gradiënt met ongeveer een dag. Zo periventriculaire endotheelcellen zijn in ruimte en tijd goed gepositioneerd om kritische aanwijzingen te verstrekken aan telencephalic neurogenese ondersteunen enneuronale migratie 4,6. Daarom zou het gebruik van embryonale periventricular endotheelcellen in coculture experimenten met neuronale voorlopercellen en / of neuronen een gunstiger model voor het bestuderen neurovasculaire interacties en het ontwikkelen van nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekte of ischemische / traumatisch hersenletsel te bieden.
We benadrukken het belang van het verwijderen van de pial membraan, niet alleen om epitheliale besmetting cel te beperken, maar ook om pial endotheelcellen die moleculair en functioneel verschillend van endotheelcellen van de periventriculaire vasculaire netwerk 4,6 (genoemd PVECs te onderscheiden van pial EC's) zijn te scheiden . Hier beschrijven we de methode die we regelmatig gebruiken in ons laboratorium een rijke en zuivere opbrengst van PVECs verkrijgen. Deze endotheelcellen zijn bereid uit embryonale voorhersenen geïsoleerd uit een getimede-zwangere muis. Zij kunnen worden uitgebreid gesubkweekt en neer bevroren succes voor toekomstig gebruik.
Protocol
Representative Results
Discussion
PVEC zijn meer fysiologisch relevante dan volwassen hersenen endotheelcellen en EC's uit ander weefsel bronnen voor onderzoek gericht op neurovasculaire interacties en ook therapeutisch potentieel. Voor PVEC voorbereiding, is het essentieel begin met dissectie snel werken om een goede levensvatbaarheid te bereiken, aangezien de dode cellen niet-specifiek kan binden aan CD31 microbolletjes. Bovendien, als eencellige suspensie niet bereikt voordat de magnetische etiket stap resulteert dit in problemen omdat celk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Nationale Alliantie voor onderzoek naar schizofrenie en depressie (NARSAD) Young Investigator Award en de National Institutes of Health verlenen R01NS073635 naar AV.
Materials
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| glutamax | Life Technologies | 305050-061 | |
| tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soyabean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Vectashield Hardset Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Flouroscent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz surgical instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz surgical instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
