Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur

Summary

Cette vidéo montre une stratégie simple et fiable pour la préparation de cultures pures de cellules endothéliales de cerveau antérieur embryonnaire dans les 10-12 jours et sera utile pour la recherche axée sur de nombreux aspects de l'angiogenèse cérébrale.

Abstract

Cellules endothéliales du cerveau embryonnaires peuvent servir comme un outil important dans l'étude de l'angiogenèse et le développement neuro-vasculaire et les interactions. Les deux réseaux vasculaires du cerveau antérieur embryonnaire, la pie-mère et périventriculaire, sont distinctes dans l'espace et avoir des origines différentes et des modèles de croissance. Les cellules endotheliales à partir des réseaux vasculaires et la pie-mère périventriculaires ont des profils uniques d'expression génique et les fonctions. Nous présentons ici un protocole étape par étape pour l'isolement, la culture, et la vérification des populations pures de cellules endothéliales à partir du réseau vasculaire périventriculaire (PVECs) du cerveau antérieur embryonnaire (télencéphale). Dans cette approche, le télencéphale dépourvue de membrane pial obtenu à partir de 15 jours embryonnaires de souris est hachée, une digestion avec de la collagénase / dispase, et on disperse mécaniquement dans une suspension cellulaire unique. PVECs sont purifiés à partir de la suspension cellulaire en utilisant une sélection positive avec l'anticorps conjugué à anti-CD-31/PECAM-1 microbilles en utilisant une forte magnétiqueProcédé de séparation. Des cellules purifiées sont cultivées sur collagène 1 boîtes de culture revêtues dans endothéliale milieu de culture de cellules jusqu'à confluence, et en outre en subculture. PVECs obtenu avec ce protocole exposition pavé et en forme de fuseau phénotypes, comme visualisé par microscopie optique à contraste de phase et microscopie de fluorescence. Pureté des cultures Pvec a été créée avec des marqueurs de cellules endothéliales. Dans nos mains, cette méthode fiable et cohérente donne des populations pures de PVECs. Ce protocole bénéficiera des études visant à obtenir un aperçu mécanistes dans le cerveau antérieur angiogenèse, la compréhension des interactions de Pvec et croisées des entretiens avec les types de cellules neuronales et détient un énorme potentiel pour l'angiogenèse thérapeutique.

Introduction

L'angiogenèse, la neurogenèse et la migration neuronale sont des événements critiques dans le système nerveux central (SNC) le développement, la réparation et la régénération. Plusieurs études ont montré que les élégantes cellules endothéliales stimulent la prolifération neuronale et vice-versa grâce à la libération de facteurs solubles et par contact direct. Nous avons trouvé curieux que dans la majorité de ces études ^1-3, tandis que progéniteurs neuronaux / cellules souches neurales sont isolées du cerveau embryonnaire, ils sont co-cultivées avec des cellules endothéliales de cerveau de l'adulte, d'autres sources de tissu adulte, ou avec des lignées de cellules endothéliales. Cela peut être dû à des difficultés techniques associées à l'isolement et la mise en culture des populations pures de cellules endothéliales de cerveau embryonnaire en partie. Cependant, l'angiogenèse, la neurogenèse, la migration neuronale et sont des événements simultanés qui se produisent dans des ordres de grandeur plus robuste dans le cerveau embryonnaire que dans le cerveau d'un adulte normal. Le réseau vasculaire périventriculaire du embryonic cerveau antérieur (télencéphale) provient d'un navire situé dans le ganglion basal ébauche et se développe sous la forme d'un gradient ordonnée de ventral à dorsal télencéphale par jour embryonnaire 11 (E11) ^4,5. Ce plexus de vaisseaux du réseau vasculaire périventriculaire se distinguent des vaisseaux pie-mère basée sur les origines, la localisation anatomique, les modèles de croissance, et la régulation du développement ^4,5. La direction de propagation du gradient de l'angiogenèse périventriculaire correspond à la pente transversale neurogenetic télencéphalique. Au sein du télencéphale, le gradient de l'angiogenèse périventriculaire et le gradient de migration des neurones GABA chevauchent tangentiellement dans l'espace ainsi ^6. En ce qui concerne la synchronisation, le gradient de l'angiogenèse est l'avance de la pente et de GABA neurone neurogenetic gradient d'environ un jour. Ainsi, les cellules endothéliales périventriculaires sont spatialement et temporellement bien placés pour fournir des indices essentiels pour soutenir la neurogenèse et télencéphaliqueneuronale ^4,6 de migration. Par conséquent, l'utilisation des cellules endothéliales périventriculaires embryonnaires dans des expériences de co-culture avec des progéniteurs et / ou des neurones neurones fournirait un modèle plus favorable pour l'étude des interactions neurovasculaires et le développement de nouvelles voies pour le traitement de maladies neurodégénératives ou une lésion cérébrale ischémique / traumatique.

Nous insistons sur l'importance d'éliminer la membrane pial, non seulement pour limiter la contamination des cellules épithéliales, mais aussi pour séparer les cellules endothéliales pie-mère qui sont moléculairement et fonctionnellement distincte de cellules endothéliales du réseau vasculaire périventriculaire ^4,6 (de PVECs appelés à distinguer de la pie-mère EC) . Ici, nous décrivons la méthode que nous utilisons régulièrement dans notre laboratoire pour obtenir un rendement riche et pur de PVECs. Ces cellules endothéliales sont préparés à partir forebrains embryonnaires isolées à partir d'un simple clic de souris chronométrée enceinte. Ils peuvent être complétés, en sous-culture, et on les congèle avec succès vers le bas pour une utilisation future.

Protocol

Une. Préparation des réactifs et solutions Revêtement de 35 mm boîte de culture: Le collagène de type 1 est fournie comme solution une solution aqueuse à 20 mM d'acide acétique (~ 100 mg de protéine / fiole). Diluer un volume approprié de solution de collagène à une concentration de travail de 0,01% en utilisant une culture tissulaire stérile eau de qualité. plats Manteau avec 1 ml de solution de collagène pour 3-4 heures à température ambiante (RT) ou 37 ° C, ou une nuit à 2-8 ° C. Enl…

Representative Results

La caractérisation phénotypique des PVECs du jour 1-12 est représenté par microscopie optique à contraste de phase (Figure 2). Les cellules fixées à l'antenne le jour 1 montrent une morphologie caractéristique de la division cellulaire (figure 2A). Entre 5-8 jours, PVECs transition de galets de pierre à la broche en forme de morphologie typique des cellules endothéliales et plus proche de son état ​​in vivo (figures 2B et 2C).</strong…

Discussion

Pvec de sont physiologiquement plus pertinent que les cellules endothéliales cérébrales adultes et EC provenant d'autres sources de tissus pour des études portant sur les interactions neurovasculaires et avoir un potentiel thérapeutique aussi. Pour la préparation PVEC, il est essentiel début à la dissection de travailler rapidement pour obtenir une bonne viabilité puisque les cellules mortes peuvent se lier de manière non spécifique à microbilles CD31. En outre, si la suspension à cellule unique n'e…

Materials

DNase I	Sigma	D-4527
Collagen, Type 1 solution from rat tail	Sigma	C3867
DPBS	Quality Biologicals	114057-131
EDTA	Fisher Scientific	M4055
BSA	Sigma	A2058
MS column	Miltenyi Biotech	130-042-201
CD31 microbeads	Miltenyi Biotech	130-097-418
MACS separator	Miltenyi Biotech	130-042-102
MACS multi stand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Cell strainer 70 µm	BD Bioscience	352350
Antibiotic and antimycotic solution	Sigma	A5955
FBS	Sigma	F4135
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001
DMEM	Lonza	12-604F
35 mm culture dish	BD Bioscience	353001
15 ml falcon tube	BD Bioscience	352097
50 ml falcon tube	BD Bioscience	352098
ECCM kit	BD Bioscience	355054	Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)	BD Bioscience	354006
RBECGM	Cell applications	R819-500
DMEM F12	Life Technologies	10565-018
glutamax	Life Technologies	305050-061
tissue culture grade water	Life Technologies	15230162
0.25% Trypsin	Life Technologies	15050
Soyabean trypsin inhibitor	BD Bioscience	5425
Matrigel	BD Bioscience	354234
Qtracker 655 Cell Labeling Kit	Life Technologies	Q25021
CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0	Life Technologies	C10608
Biotinylated Isolectin B4 antibody	Sigma	L2140
Anti-Von Willebrand factor	Sigma	F3520
Anti-CD31/PECAM-1	BD Pharmingen	550274
Vectashield Hardset Mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Ketamine	Butler Schein Animal Health Supply	44028
Xylazine	Lloyd Laboratories	1009
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
hemocytometer	Fisher Scientific	267110
inverted microscope	Olympus CK-40	CK-40
Flouroscent microscope	Olympus FSX-100	FSX-100
Fine forceps	Roboz surgical instrument	7 inox
Fine microtip scissors	Roboz surgical instrument	RS5611