בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי
Summary
וידאו זה מדגים אסטרטגיה קלה ואמינה להכנת תרבויות טהורות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי העוברי בתוך 10-12 ימים ויהיה שימושי עבור מחקר התמקד בהיבטים רבים של אנגיוגנזה מוחין.
Abstract
תאי האנדותל המוח עובריים יכולים לשמש ככלי חשוב במחקר של אנגיוגנזה ופיתוח neurovascular ואינטראקציות. שתי רשתות כלי הדם של המוח הקדמי העוברי, pial וperiventricular, הן במרחב ייחודיים ויש להם מקורות שונים ודפוסי צמיחה. יש תאי אנדותל מרשתות כלי דם pial וperiventricular פרופילים ייחודיים ביטוי גנים ופונקציות. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד לבידוד, תרבות, ואימות של אוכלוסיות טהורות של תאי האנדותל מרשת periventricular כלי הדם (PVECs) של המוח הקדמי העוברי (telencephalon). בגישה זו, telencephalon נטולת קרום pial מתקבל מיום עוברי 15 עכברים טחונים, מעוכל עם collagenase / dispase, והתפזרה באופן מכאני לתוך השעיה תא בודדת. PVECs הם מטוהרים מהשעית תא באמצעות סלקציה חיובית עם נוגדן anti-CD-31/PECAM-1 מצומדת לmicrobeads באמצעות חזק מגנטישיטת הפרדה. תאים מטוהרים בתרבית על קולגן 1 מנות תרבות מצופים במדיום תרבית תאי האנדותל עד שהם הופכים ומחוברות וsubcultured נוסף. PVECs שהושג עם מרוצף זה פרוטוקול תערוכה ופנוטיפים ציר בצורה, כפי שדמיין ידי מיקרוסקופ אור שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. טוהר של תרבויות PVEC הוקם עם סמני תא האנדותל. בידיים שלנו, שיטה זו אמינה ועקבי תשואות אוכלוסיות טהורות של PVECs. פרוטוקול זה יהיה לטובת מחקרים שמטרתם להשיג תובנות מכניסטית לאנגיוגנזה המוח הקדמי, הבנת אינטראקציות PVEC, ושיחות צולבות עם סוגים עצביים תא ובעל פוטנציאל אדיר לאנגיוגנזה הטיפולית.
Introduction
אנגיוגנזה, נוירוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים קריטיים במערכת עצבים מרכזית (CNS) פיתוח, תיקון והתחדשות. מספר מחקרים אלגנטיים הראו כי תאי האנדותל לעורר התפשטות עצבית ולהיפך באמצעות שחרורם של גורמים מסיסים ועל ידי מגע ישיר. מצאנו את זה מוזר, כי ברוב המחקרים הללו 1-3, ואילו אבות עצביים / תאי גזע עצביים מבודדים מהמוח העוברי, הם cocultured עם תאי אנדותל מהמוח הבוגר, מקורות רקמות מבוגרים אחרים, או עם שורות תאי האנדותל. זה עשוי בחלקו להיות בשל הקשיים הטכניים הקשורים לבידוד וculturing אוכלוסיות טהורות של תאי האנדותל מהמוח העוברי. עם זאת, אנגיוגנזה, נוירוגנזה, ונדידת נוירונים הן אירועים מקבילים המתרחשים בסדרי גודל חזק יותר במוח העוברי מאשר במוח המבוגר הנורמלי. רשת כלי דם periventricular של embryoniמוח קדמי ג (telencephalon) מקורו בכלי הממוקם בתוך primordium הגרעינים הבזליים ומתפתח בצורת הדרגתית מסודר מגחון להגבה telencephalon ידי היום עוברי 11 (E11) 4,5. מקלעת זו של כלי שיט של רשת כלי דם periventricular נבדלת כלי pial מבוסס על מקורות, מיקום האנטומי, דפוסי צמיחה, ורגולציה התפתחותית 4,5. הכיוון של התפשטות של שיפוע אנגיוגנזה periventricular תואם את שיפוע neurogenetic הרוחבי telencephalic. בתוך telencephalon, שיפוע אנגיוגנזה periventricular והשיפוע של נוירונים GABA הנודדים בעקיפין חופף מרחבית, כמו גם 6. עם כל כבוד לעיתוי, שיפוע אנגיוגנזה הוא מראש של שיפוע השיפוע ונוירון GABA neurogenetic ידי על יום. לכן, תאי האנדותל periventricular הם מרחב ובזמן בעמדה טובה כדי לספק רמזים קריטיים לתמוך נוירוגנזה telencephalic ו4,6 נדידת נוירונים. לכן, שימוש בתאי אנדותל periventricular עובריים בניסויי coculture עם אבות ו / או נוירונים עצביים יספק מודל חיובי יותר ללימוד אינטראקציות עצבים וכלי דם ובפיתוח אפיקים חדשים לטיפול במחלות ניווניות או פגיעה המוחית איסכמי / טראומטית.
אנו מדגישים את החשיבות של הסרת קרום pial, לא רק כדי להגביל את זיהום תאי אפיתל, אלא גם כדי להפריד בין תאי האנדותל pial אשר מולקולריים ומובחנים מבחינה פונקציונלית מתאי האנדותל של הרשת periventricular כלי דם 4,6 (PVECs מכונה להבדיל מECs pial) . כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו משתמשים באופן שיגרתי במעבדה שלנו כדי להשיג תשואה עשירה וטהורה של PVECs. תאי האנדותל אלה הוכנו מforebrains העוברי בודד מעכבר מתוזמן בהריון אחד. הם יכולים להיות מורחבים, subcultured, וקפוא למטה בהצלחה לשימוש עתידי.
Protocol
Representative Results
Discussion
PVEC של יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מאשר תאי בוגרים מוח אנדותל וECs ממקורות רקמות אחרים ללימודים המתמקדים באינטראקציות עצבים וכלי דם וגם יש פוטנציאל טיפולי. להכנת PVEC, זה קריטי עם תחילת נתיחה כדי לעבוד מהר כדי להשיג את כדאיות טובה שכן תאים מתים עלולים להיקשר nonspecifically ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ברית לאומית לחקר סכיזופרניה ודיכאון (NARSAD) פרס חוקר צעיר ומכונים הלאומיים לבריאות מענק R01NS073635 לAV.
Materials
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| glutamax | Life Technologies | 305050-061 | |
| tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soyabean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Vectashield Hardset Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Flouroscent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz surgical instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz surgical instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
