Summary

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

Published: January 23, 2014
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Summary

このビデオでは、10〜12日以内に、胚前脳からの内皮細胞の純粋培養を調製するための簡単​​で信頼性の高い戦略を示し、脳血管新生のさまざまな側面に焦点を当てた研究のために有用であろう。

Abstract

胚の脳内皮細胞は、血管新生および神経血管の発達との相互作用の研究における重要なツールとして機能することができる。胚前脳、軟膜および脳室周囲の2血管網は、空間的に独特であり、異なる起源と成長パターンを持っている。軟膜および脳室周囲血管網から​​の内皮細胞は、固有の遺伝子発現プロフィールおよび機能を有している。ここでは、胚前脳(終脳)の脳室周囲血管網(PVECs)からの内皮細胞の純粋な集団の単離、文化、および検証のためのステップバイステップのプロトコルを提示する。このアプローチでは、胎齢15日のマウスから得た軟膜膜を欠く終脳は、みじん切りされたコラゲナーゼ/ディスパーゼを用いて消化し、単一細胞懸濁液中に機械的に分散した。 PVECsは強い磁場を使用してマイクロビーズに結合させanti-CD-31/PECAM-1抗体で陽性選択を用いて細胞懸濁液から精製される分離方法。コンフルエントとなるまで、さらに継代培養細胞は、精製された内皮細胞培養培地中のコラーゲン1コーティングした培養皿上で培養される。位相差光学顕微鏡、蛍光顕微鏡で可視化されるようPVECsは、このプロトコルの展示石畳と紡錘形の表現型を用いて得られる。 PVEC培養の純度は、内皮細胞のマーカーで設立されました。私たちの手では、この方法では、確実にかつ一貫してPVECsの純粋な集団が得られます。このプロトコルは、前脳の血管新生への機械論的な洞察を得るPVEC相互作用、および神経細胞の種類とのクロストークを理解し、治療的血管形成のための途方もない可能性を秘めていることを目的とした研究の利益になる。

Introduction

血管新生、神経発生および神経細胞移動は、中枢神経系(CNS)の開発、修復および再生における重要な事象である。いくつかのエレガントな研究は、内皮細胞が可溶性因子の放出を介して直接接触することによりニューロンの増殖およびその逆を刺激することが示されている。我々はそれが好奇心これらの研究1-3の大部分であることが見出さ神経前駆細胞/神経幹細胞は、胚の脳から単離されている間、それらは成人の脳、他の成体組織源から、または内皮細胞株と内皮細胞と共培養される。これは、部分的には、胚の脳から内皮細胞の純粋な集団を単離し、培養に関連する技術的な問題が原因である可能性があります。しかし、血管形成、神経発生、および神経細胞の移行は、より堅牢な胚の脳の正常な成人の脳に比べて桁違いに生じる同時イベントです。 embryoniの脳室周囲血管網Cの前脳(終脳)は、大脳基底核の原基内にある容器から発信され、胎生11(E11)4,5で終脳背側腹側からの整然とした勾配の形で開発しています。脳室周囲血管網の血管のこの神経叢は起源、解剖学的位置、成長パターン、および発生調節4,5に基づき、軟膜血管とは異なります。脳室周囲の血管新生勾配の伝播方向は、終脳の横断神経遺伝勾配と一致します。終脳内では、脳室周囲の血管新生勾配及び移行のGABAニューロンの勾配は接線方向にも空間的に6に重なる。タイミングに関しては、血管新生勾配は、約日までに神経遺伝勾配及びGABAニューロン勾配の進んでいる。したがって、内皮細胞は、脳室周囲空間的および時間的によく終脳の神経発生をサポートするために重要な手がかりを提供するように配置され、ニューロン移動4,6。したがって、神経前駆細胞及び/又はニューロンと共培養実験において、胚性脳室周囲の内皮細胞の使用は、神経血管の相互作用を研究し、神経変性疾患または虚血性/外傷性脳損傷の治療のための新規な手段を開発するためのより良好なモデルを提供するであろう。

我々は、上皮細胞の混入を制限することなく、分子的および脳室周囲血管網4,6(軟膜のECと区別するPVECs称される)の内皮細胞からの機能的に区別される軟膜血管内皮細胞を分離するだけでなく、軟膜膜を除去することの重要性を強調。ここでは、私たちが日常的にPVECsの豊かで純粋な収量を得るために、我々の研究室で使用する方法について説明します。これらの内皮細胞は、単一の時限妊娠マウスから単離された胚性前脳から調製される。これらは、膨張継代培養し、将来の使用のために正常に凍結することができる。

Protocol

1。試薬および溶液の調製の 35mm培養皿のコーティング:コラーゲン1型溶液を、20mM酢酸(〜100mgのタンパク質/バイアル)中の水溶液として供給される。滅菌組織培養グレードの水を用いて0.01%の使用濃度にコラーゲン溶液の適切な容量に希釈する。 2〜8℃で、室温(RT)又は37℃で3-4時間、コラーゲン溶液1ml、または一晩でコートディッシュコー​​トディッシュから余分な溶液を除?…

Representative Results

1-12日目からPVECsの表現型の特徴は、位相差光学顕微鏡検査( 図2)によって示されている。細胞分裂( 図2A)の1日目を表示形態学特性上皿に付着した細胞。 5-8日の間、石畳からPVECs遷移は、内皮細胞およびそのin vivoの状態( 図2Bおよび2C)により類似の典型的な形の形態をスピンドルます。 12日目までにPVEC文化が完全な合流点( <stro…

Discussion

PVEC年代は、より生理学的に関連する神経血管の相互作用に焦点を当てた研究のための他の組織源からの大人の脳内皮細胞とのECよりもあり、また治療の可能性を持っている。 PVECの準備のためには、死んだ細胞は、CD31マイクロビーズに非特異的に結合することができるので、優れた実行可能性を達成するために、高速動作するように郭清を伴う重要な始まりです。単一細胞懸濁液は、従来の…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、統合失調症研究のための国民の同盟とうつ病(NARSAD)若手研究者賞と米国立衛生研究所のAVにR01NS073635を助成金によってサポートされていました。

Materials

DNase I Sigma D-4527
Collagen, Type 1 solution from rat tail Sigma C3867
DPBS Quality Biologicals 114057-131
EDTA Fisher Scientific M4055
BSA Sigma A2058
MS column Miltenyi Biotech 130-042-201
CD31 microbeads Miltenyi Biotech 130-097-418
MACS separator Miltenyi Biotech 130-042-102
MACS multi stand Miltenyi Biotech 130-042-303
Cell strainer 70 µm BD Bioscience 352350
Antibiotic and antimycotic solution Sigma A5955
FBS Sigma F4135
Collagenase/Dispase Roche 10269638001
DMEM Lonza 12-604F
35 mm culture dish BD Bioscience 353001
15 ml falcon tube BD Bioscience 352097
50 ml falcon tube BD Bioscience 352098
ECCM kit BD Bioscience 355054 Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Bioscience 354006
RBECGM Cell applications R819-500
DMEM F12 Life Technologies 10565-018
glutamax Life Technologies 305050-061
tissue culture grade water Life Technologies 15230162
0.25% Trypsin Life Technologies 15050
Soyabean trypsin inhibitor BD Bioscience 5425
Matrigel BD Bioscience 354234
Qtracker 655 Cell Labeling Kit Life Technologies Q25021
CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 Life Technologies C10608
Biotinylated Isolectin B4 antibody Sigma L2140
Anti-Von Willebrand factor Sigma F3520
Anti-CD31/PECAM-1 BD Pharmingen 550274
Vectashield Hardset Mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1500
Ketamine Butler Schein Animal Health Supply 44028
Xylazine Lloyd Laboratories 1009
Stereomicroscope Motic SMZ-168
hemocytometer Fisher Scientific 267110
inverted microscope Olympus CK-40 CK-40
Flouroscent microscope Olympus FSX-100 FSX-100
Fine forceps Roboz surgical instrument 7 inox
Fine microtip scissors Roboz surgical instrument RS5611

References

  1. Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  2. Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
  3. Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
  4. Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
  5. Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
  6. Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
  7. Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
  8. Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
  9. Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
  10. Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
  11. Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).

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Cite This Article
Kumar T., P., Vasudevan, A. Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain. J. Vis. Exp. (83), e51021, doi:10.3791/51021 (2014).

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