Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü
Summary
Bu video 10-12 gün içinde embriyonik ön beyin endotel hücreleri saf kültürlerin hazırlanması için kolay ve güvenilir bir strateji gösterir ve serebral damar birçok açıdan odaklanmış araştırma için yararlı olacaktır.
Abstract
Embriyonik beyin endotel hücreleri anjiyogenez ve nörovasküler gelişim ve etkileşim çalışmasında önemli bir araç olarak hizmet edebilir. Embriyonik ön beyin, PIAL ve periventriküler iki damar ağları, mekansal farklı ve farklı kökenleri ve büyüme desenler var. Pial ve periventriküler damar ağlarından endotel hücreleri benzersiz gen ekspresyon profillerini ve işlevleri vardır. Burada embriyonik ön beyin (telencephalon) periventriküler damar ağı (PVECs) endotel hücrelerinin saf popülasyonlarının izolasyonu, kültür ve doğrulama için bir adım adım protokol mevcut. Bu yaklaşımda, embriyonik gün 15 farenin elde pial membran yoksun telencephalon, doğrandı kolajenaz / dispaz ile sindirilir ve tek bir hücre süspansiyonu içine mekanik olarak dağıtılabilir. PVECs güçlü bir manyetik kullanılarak mikro, konjüge anti-CD-31/PECAM-1 antikoru ile pozitif seçim kullanılarak hücre süspansiyonundan saflaştınlırayırma yöntemi. Bunlar birbirine karıştırılmış ve bundan başka, alt-kültürlenmiş olana kadar saflaştırılmış hücreler, endotelyal hücre kültür ortamı içinde 1 kollajen kaplı kültür tabakları üzerinde kültürlenmiştir. Faz-kontrast ışık mikroskobu ve floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir gibi PVECs, bu protokol sergi parkelerde ve iğ biçimli fenotipleri ile elde. PVEC kültürlerin saflığı endotel hücre belirleyicileri ile kurulmuştur. Bizim ellerde, bu yöntem güvenilir ve tutarlı PVECs saf popülasyonları verir. Bu protokol, ön beyin anjiyojenezde içine mekanik bakış açısı kazanıyor PVEC etkileşimleri ve nöronal hücre tipleri ile çapraz görüşmeleri anlayış ve terapötik anjiyogenez için muazzam bir potansiyele sahiptir hedefleyen çalışmaları yararlanacaktır.
Introduction
Anjiyogenezis, nöron ve nöronal göç merkezi sinir sistemi (MSS) geliştirme, onarım ve rejenerasyon kritik olaylar. Çeşitli çalışmalar, zarif, endotel hücreleri, çözünebilir faktörleri serbest bırakılması yoluyla ve doğrudan temas ile nöronal proliferasyonu ve tersi uyardığını göstermiştir. Biz meraklı nöronal progenitorlar / nöral kök hücre, embriyonik beyninden izole ise bu çalışmaların çoğunda 1-3, bunlar yetişkin beyin, diğer yetişkin doku kaynakları, veya endotelyal hücre hatları ile endotel hücreleri ile kültürlenmiş olduğu bulundu. Bu kısmen embriyonik beyin endotel hücreleri popülasyonları saf izole edilmesi ve kültür ile ilgili teknik zorluklar nedeniyle olabilir. Ancak, anjiyogenez, nöron oluşumu, ve nöronal migrasyon, normal erişkin beyinde daha embriyonik beyinde daha sağlam büyüklükte emir meydana gelen eşzamanlı olaylardır. Embryoni ait periventriküler damar ağıc ön beyin (telencephalon) bazal ganglia primordiumunun içinde yer alan bir kaptan kaynaklanan ve embriyonik gün 11 (E11) 4,5 ile telencephalon dorsal ventral gelen düzenli bir gradyan şeklinde gelişir. Periventriküler damar ağı damarlarının Bu pleksus kökenleri, anatomik konumu, büyüme modelleri ve gelişim düzenlemesi 4,5 dayalı Pial gemiler farklıdır. Periventriküler anjiyogenez degrade yayılma yönü telencephalic enine nörogenetik degrade eşleşir. Telencephalon içinde, periventriküler anjiyogenez degrade ve göç GABA nöron degrade teğet yanı sıra mekansal 6 çakışıyor. Zamanlama ile ilgili olarak, anjiyojenez gradyan yaklaşık bir gün ile nörogenetik gradyanı ve GABA nöron gradyanı önceden olduğu. Böylece, periventriküler endotel hücreleri mekansal ve zamansal iyi telencephalic nörogenezi desteklemek için kritik ipuçları sağlamak için konumlandırılmış venöronal migrasyon 4,6. Bu nedenle, nöronal soylarının ve / veya nöronlarla kokültürü deneylerde embriyonik periventriküler endotel hücrelerinin kullanımı nörovasküler etkileşimlerin incelenmesinde ve nörodejeneratif hastalık veya iskemik / travmatik beyin hasarı tedavisi için yeni yollar geliştirmek için daha uygun bir modeli sağlayacaktır.
Biz, epitel hücre bulaşma sınırlamak için değil, aynı zamanda moleküler ve periventriküler damar ağı 4,6 (Pial EC'ler ayırmak adlandırılır PVECs) endotel hücrelerinden fonksiyonel olarak farklı olan Pial endotel hücreleri ayırmak için değil, sadece Pial membran kaldırma önemini vurgulamaktadır . Burada, biz rutin PVECs zengin ve saf verim elde etmek bizim laboratuvarımızda kullandığımız yöntem tarif. Bu endotel hücreleri, tek bir zaman ayarlı gebe fare izole edilmiş embriyonik forebrains hazırlanır. Onlar ileride kullanmak için başarılı bir şekilde, genişletilmiş alt kültürleri ve aşağı donmuş olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
PVEC ait daha fazla fizyolojik olarak uygun nörovasküler etkileşimleri ilgili çalışma other doku kaynaklarından erişkin beyin endotel hücreleri ve EC 'den ve aynı zamanda tedavi edici potansiyele sahiptir. PVEC hazırlanması için, ölü hücrelerin CD31 mikro, için spesifik olmayan bağlamak olabilir çünkü iyi bir canlılığı elde etmek için hızlı çalışması için diseksiyon ile kritik bir başlangıçtır. Tek hücre süspansiyonu önce manyetik etiketleme aşamasından elde değilse, hücre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Şizofreni Araştırmaları Ulusal İttifak ve Depresyon (NARSAD) Genç Araştırmacı Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri AV R01NS073635 hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| glutamax | Life Technologies | 305050-061 | |
| tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soyabean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Vectashield Hardset Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Flouroscent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz surgical instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz surgical instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
