형광<em> 현장에서</em바이러스 및 식물과 곤충 조직에서 Endosymbiotic 박테리아의 지역화를위한> 혼성화 (FISH)
Summary
우리는 곤충과 식물 조직에서 바이러스와 박테리아의 현지화 여기 현장 하이브리드 화에 간단한 형광 (FISH) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전체 산에서의 mRNA의 시각화 및 미세한 부분에 대한 확장 할 수 있습니다.
Abstract
현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 일반적으로 진핵 세포의 유전자 사본을 시각화하고 추가 바이러스 나 세균 감염과 같은 세포의 다른 구성 요소를 시각화하기 위해 수정 될 수 있습니다에 사용되는 다양한 기술에 주어진 이름입니다. 공간 현지화 및 감염 과정에서 바이러스와 박테리아의 시각화는 다른 자극에 대한 응답으로 이러한 마이크로 어레이 및 RNAseq로 표현 프로파일 링 실험을 보완하는 필수 단계입니다. 이러한 에이전트와 시공간 감염을 이해하는 세포 구성 요소와의 상호 작용을 이해하기위한 생물학적 실험을 보완합니다. 이러한 리포터 유전자 시스템이나 면역 조직 화학적 방법으로 바이러스와 박테리아를 시각화하는 몇 가지 기술은 시간이 많이 소요되어, 일부는 모델 생물로 작업하고 복잡한 방법을 포함하도록 제한됩니다. 세포 내에서 RNA 또는 DNA 종을 대상으로 FISH는 상대적으로 쉽고 빠른 날입니다유전자의 시공간 현지화을 연구 및 진단 목적으로 THOD. 이 방법은 강력하고 프로토콜이 비싸지 않다 짧은 혼성화, 시중에서 구입 한 프로브를 사용하면 비교적 쉽게 구현할 수 있습니다. 샘플 준비, 고정, 하이브리드, 현미경 시각화 복잡한 단계를 포함하지 않는 경우에 특히 강력합니다. 여기에서 우리는 곤충과 식물 조직에서 박테리아와 바이러스의 현지화를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 자신의 5 '또는 3'에 형광 염료에 접합 된 짧은 DNA 프로브가 종료 20 염기쌍 간단한 준비, 고정, 곤충 전체 마운트 및 해부 기관 또는 손으로 만든 플랜트 섹션의 하이브리드 화에 기반하고있다. 이 프로토콜은 성공적 곤충 및 식물 조직의 개수에인가되었으며, 셀에서의 mRNA 또는 기타 RNA 또는 DNA 종의 발현을 분석하기 위해 사용될 수있다.
Introduction
감염된 식물들은 호스트와 식물 바이러스 및 기타 병원체 간의 상호 작용을 연구 할 때, 그것은 그들이 호스트에 부정적인 영향을 야기하는지 여부를 불문하고, 동일 반응계에서 병원균 및 각각 핵산을 시각화하는 것이 중요하다. 식물 세포 내와 사이에 병원균의 움직임을 연구 할 때이 가장 중요하다. 병원체의 유전자 제품의 현장 현지화에서 병원성 과정을 연구하기위한 다른 방법을 보완하는 필수적인 단계이다. 많은 식물 병원체, 특히 바이러스는 자신의 벡터를 복잡하고 친밀한 상호 작용을 갖는 곤충에 의해 전달된다. 자신의 그림에있는이 바이러스의 현지화 전송 경로를 연구하는데 중요하고, 벡터 내부의 가능한 상호 작용 사이트. 일부 곤충 벡터가 식물 바이러스의 전송은 이들 곤충에 상주 endosymbiotic 박테리아에 의해 도움을 받는다. 더 나은 이러한 식물 바이러스 B의 전송을 연구하는자신의 벡터, 그것은 일반적으로 endosymbiotic 박테리아를 시각화, 특히 바이러스의 전송에 관련된 사람들, 또한 필수적입니다 Y. 바이러스와 endosymbiotic 박테리아의 colocalization을 따라서 자신의 곤충 호스트 이내에 생물 사이의 가능한 관계를 조사를 위해 요구된다. 이외에도 바이러스 전송에서, endosymbiotic 박테리아가 곤충 벡터의 생물학의 여러 측면에 영향을 미치는, 곤충 이내에 세균 따라서 공간 현지화 높은 관심과 중요하다.
토마토 노란 잎 말림 바이러스 (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae)는 전 세계적으로 1-4 재배 토마토의 가장 중요한 바이러스 성 질병의 복잡합니다. TYLCV는 사부 제한 바이러스 독점적 가루이 담배가 담배가 루이 5,6에 의해 벡터가된다. 자신의 가루이 벡터의 begomoviruses의 전위를 설명하는 모델은 6-9 제안되었다. 두 가지 특정 장벽을 적극적으로 DUR 교차중장 / 체액과 체액 / 침샘 장벽이이 순환 전송을 보내고. 이 송신 처리는 바이러스 캡시드를 인식 불명 수용체에 의해 매개되는 것으로 가정된다. TYLCV는 B를 교차 생각된다 이 식물에 주입되기 전에 담배가 루이의 중장 6,10, 그리고는 기본 침샘 (6)을 통해 흡수된다. 가루이 체액에서 TYLCV는 곤충 보조 endosymbiotic 박테리아 Hamiltonella에 의해 생산의 GroEL 단백질과 상호 작용합니다.이 상호 작용은 체액에서 TYLCV의 안전한 전송을 보장하고, 곤충의 면역 체계 11. Hamiltonella 및 Portiera, 기본 endosymbiont의 공격으로부터 보호 가루이의, bacteriocytes에 보관되어, 체액 및 집 endosymbiotic 박테리아 11. B.에서 발견 된 곤충 세포 담배가 루이는 리케차, Arsenophonus, Wolbachia 및 프리쉬 등의 추가 endosymbiotic 박테리아를 항구bacteriocytes 내부 또는 외부에 현지화 할 수 있으며, EA는, 곤충의 생물학 (12)에 다양한 영향을 미친다.
여러 보고서가 미세한 두께 섹션 10, 13에 현장에서 이러한 투과 전자 현미경 (TEM), 항체 및 RNA 등 많은 시간과 비용이 많이 드는 프로토콜을 사용하여 식물과 가루이의 TYLCV의 현지화를 연구하려고했습니다, 최근의 연구는 지역화를 설명 간단한 프로토콜 14을 사용하여 자신의 공장 및 벡터 호스트 내부의 식물 바이러스의. 여기에서 우리는 B에서 TYLCV의 지역화를위한 간단한 프로토콜을 설명 담배가 루이가 인 midguts과 침샘을 해부하고, 절에서 TYLCV에 감염된 식물에서 준비했습니다. 우리는 더 Portiera, B의 기본 endosymbiont의 현지화를 설명 담배가 루이, 그 차 endosymbionts Hamitonella, 리케차 및 Arsenophonus은.이 프로토콜은 짧은 DNA 프로브를 사용을 기반으로하는찬란하게 자신의 5 '말단에 표시하고, 특히 바이러스 성 또는 세균성 유전자 서열에 상보적인 서열에 하이브리드된다. 샘플 처리는 비교적 쉽게 얻어진 신호는 매우 다릅니다. 기술 된 프로토콜은 식물, 동물 및 곤충 호스트에서 바이러스, 세균 및 기타 병원체를 집중하는 데 사용될 수 있고, 추가로 임의의 주어진 조직에서 mRNA를 지역화하는데 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그 공장 주인과 곤충 벡터 식물 바이러스의 현지화 및 특정 가루이 호스트에 endosymbiotic 박테리아 여기에 설명 된 프로토콜은, 식물, 심지어는 동물 조직에서 다른 바이러스의 현지화에 적용 할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 endosymbiotic 병원성 박테리아와 식물과 동물의 시스템에서 다른 미생물을 지역화하는 데 사용할 수 있습니다. 기술 된 방법은 짧은, 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ghanim 실험실에서 연구는 더 연구 보조금에 의해 지원되지 않았다. 독일 – 이스라엘 재단 (GIF)에서 908-42.12/2006는, 아니 부여합니다. IS-4062-07 미국 – 이스라엘 양국 농업 연구 개발 기금 (BARD), 연구 보조금 아니요. MG 이스라엘 과학 재단 (ISF)에서 884 / 07
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
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