مضان<em> في الموقع</em> التهجين (FISH) لتوطين الفيروسات والبكتيريا Endosymbiotic في النبات والحشرات مناديل
Summary
نحن هنا وصف بسيط مضان التهجين في الموضع (FISH) طريقة لتوطين الفيروسات والبكتيريا في أنسجة الحشرات والنبات. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتصور مرنا في جبل بأكمله والمقاطع المجهرية.
Abstract
مضان التهجين في الموقع (FISH) في هو الاسم الذي يطلق على مجموعة متنوعة من التقنيات التي تستخدم عادة لتصور النصوص الجينات في الخلايا حقيقية النواة ويمكن تعديل أخرى لتصور المكونات الأخرى في الخلية مثل العدوى الناجمة عن فيروسات والبكتيريا. توطين المكاني والتصور من الفيروسات والبكتيريا أثناء عملية العدوى هو خطوة أساسية أن يكمل التعبير التنميط التجارب مثل ميكروأرس وRNAseq استجابة لمحفزات مختلفة. فهم التهابات الزمانية المكانية مع هذه العوامل تكمل التجارب البيولوجية التي تهدف إلى فهم تفاعلها مع المكونات الخلوية. العديد من التقنيات لتصور الفيروسات والبكتيريا مثل نظم الجين المراسل أو أساليب المناعى هي مضيعة للوقت، وبعض تقتصر على العمل مع الكائنات نموذج وتنطوي منهجيات معقدة. FISH الذي يستهدف الأنواع الحمض النووي الريبي DNA أو في الخلية هو لي سهلة نسبيا وسريعةثود لدراسة توطين الزمانية المكانية من الجينات ولأغراض التشخيص. هذا الأسلوب يمكن أن تكون قوية وسهلة نسبيا لتنفيذ عندما تستخدم البروتوكولات التهجين قصيرة، تحقيقات شراؤها تجاريا، والتي هي ليست مكلفة. هذا هو قوي ولا سيما عندما إعداد العينات، والتثبيت، والتهجين، والتصور المجهرية لا تنطوي الخطوات المعقدة. نحن هنا وصف بروتوكول للتوطين البكتيريا والفيروسات في أنسجة الحشرات والنبات. وتستند هذه الطريقة على إعداد بسيطة، التثبيت، وتهجين يتصاعد كله الحشرات وأجهزة تشريح أو أقسام المصنع المصنوعة يدويا، مع 20 زوجا قاعدة تحقيقات الحمض النووي قصيرة مترافق إلى الأصباغ الفلورية على هم 5 'أو 3' ينتهي. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح لعدد من أنسجة الحشرات والنباتات، ويمكن استخدامها لتحليل التعبير عن mRNAs وأو الأنواع الحمض النووي الريبي DNA أو أخرى في الخلية.
Introduction
عند دراسة التفاعلات بين الفيروسات النباتية ومسببات الأمراض الأخرى مع المضيفين النباتية المصابة، فمن المهم أن تصور مسببات الأمراض والأحماض النووية الخاصة بها في الموقع، بغض النظر عما إذا كانت تتسبب في آثار سلبية على مضيفيهم. وهذا هو الأكثر أهمية عند دراسة حركة الممرض داخل وبين الخلايا النباتية. في توطين الموضع من المنتجات الجينات من مسببات المرض هو الخطوة الأساسية التي يكمل نهج أخرى لدراسة عملية المرضية. العديد من مسببات الأمراض النباتية، وخاصة الفيروسات، وتنتقل عن طريق الحشرات، بعد أن التفاعلات المعقدة والحميمة مع ناقلاتها. توطين هذه الفيروسات في ناقلاتها المهم لدراسة مسار انتقال، ومواقع التفاعل ممكن داخل النواقل. وساعد انتقال بعض الفيروسات النباتية تنقلها الحشرات، عن طريق البكتيريا الموجودة داخل endosymbiotic هذه الحشرات. لدراسة أفضل من انتقال هذه الفيروسات النباتية بذ ناقلات بهم، بل هو أيضا ضروري لتصور البكتيريا endosymbiotic بشكل عام، والذين يشاركون في انتقال الفيروس، على وجه الخصوص. وبالتالي المطلوب Colocalization من الفيروسات والبكتيريا endosymbiotic للتحقيق في العلاقات الممكنة بين هذه الكائنات الحية داخل المضيفة الحشرات. وبصرف النظر عن انتقال الفيروس والبكتيريا endosymbiotic تؤثر عدة جوانب بيولوجيا الحشرات الناقلة للأمراض، وبالتالي توطين المكاني لهذه البكتيريا داخل الحشرات هي من الفائدة المرتفعة وأهميتها.
الطماطم ورقة صفراء حليقة فيروس (TYLCV) (Begomovirus، Geminiviridae) هو مرض فيروسي المعقدة أهم من الطماطم المزروعة في جميع أنحاء العالم 1-4. TYLCV هو فيروس محدودة اللحاء وتنقلها حصريا من قبل الذبابة البيضاء Bemisia الذبابة البيضاء 5،6. وقد تم اقتراح نموذج يصف إزفاء من begomoviruses في ناقلاتها الذبابة البيضاء 6-9. وعبرت حاجزين محددة بنشاط الدرجي هذا الإرسال circulative: المعي المتوسط / الدملمف والحواجز الغدة الدملمف / اللعابية. هو الافتراض هذه العملية إحالته إلى أن بوساطة مستقبلات مجهولة التي تعترف قفيصة الفيروس. ويعتقد TYLCV لعبور B. يمتص المعي المتوسط 6،10 الذبابة البيضاء، وذلك من خلال الغدة اللعابية الابتدائي 6 قبل أن يتم حقنه في المصنع. في الدملمف الذبابة البيضاء، يتفاعل مع بروتين TYLCV GroEL التي تنتجها الحشرات الثانوية endosymbiotic بكتيريا Hamiltonella. يضمن هذا التفاعل النقل الآمن للTYLCV في الدملمف، ويحميها من هجوم من قبل النظام المناعي الحشرات 11. Hamiltonella وPortiera، ومعايش جواني الابتدائي من الذباب الأبيض، ويعيش في bacteriocytes، خلايا الحشرات وجدت في الدملمف وendosymbiotic منزل البكتيريا 11. B. الذبابة البيضاء تؤوي البكتيريا endosymbiotic إضافية بما في ذلك الريكتسية، Arsenophonus، الولبخية، وفريتشعصام، والتي يمكن أن تكون مترجمة داخل bacteriocytes أو خارجها، ولها تأثيرات متنوعة على البيولوجيا الحشرة 12.
وقد حاول العديد من التقارير لدراسة توطين TYLCV في النباتات والذباب الأبيض باستخدام بروتوكولات تستغرق وقتا طويلا ومكلفة مثل نقل المجهر الإلكتروني (TEM)، والأجسام المضادة والحمض النووي الريبي في الموقع في قسم سميكة المجهرية 10،13، وصفت دراسة حديثة للتوطين من الفيروسات النباتية داخل المصنع وناقلات مضيفيهم باستخدام بروتوكول بسيطة 14. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة لتوطين TYLCV في B. تشريح الذبابة البيضاء midguts والغدد اللعابية، وأقسام المحضرة من النباتات TYLCV المصابة. وصفنا كذلك توطين Portiera، ومعايش جواني الرئيسي للB. الذبابة البيضاء، وendosymbionts الثانوية في Hamitonella، الريكتسية وArsenophonus. ويستند هذا البروتوكول على استخدام الحمض النووي تحقيقات قصيرة، أنوfluorescently المسمى على هم 'نهاية 5، وهجن خصيصا لتسلسل تكميلية في تسلسل الجينات الفيروسية أو البكتيرية. تجهيز عينة من السهل نسبيا وإشارة حصلنا عليها محددة للغاية. بروتوكول وصف يمكن استخدامها لتوطين الفيروسات والبكتيريا ومسببات الأمراض الأخرى في المضيفين النبات والحيوان والحشرات، ويمكن وأن تستخدم أيضا للتوطين مرنا في أي نسيج معين.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا لتوطين فيروس مصنع في مصنعها المضيف وناقلات الامراض والحشرات، والبكتيريا endosymbiotic في المضيف الذبابة البيضاء محددة، ويمكن تكييفها لتوطين الفيروسات الأخرى في النباتات وحتى في الأنسجة الحيوانية. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول يمكن استخدامها لتوطين…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد البحوث في المختبر بواسطة غانم منحة بحثية لا. 908-42.12/2006 من المؤسسة الألمانية الإسرائيلية (GIF)، منح لا. IS-4062-07 من إسرائيل، الولايات المتحدة الثنائية للصندوق للبحوث الزراعية والتنمية (BARD)، ومنحة بحثية لا. 884/07 من مؤسسة العلوم اسرائيل (ISF) إلى MG
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
References
- Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
- Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
- Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
- Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
- Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
- Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
- Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
- Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
- Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
- Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
- Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
- Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
- Ghanim, M., Medina, V., Czosnek, H. . Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. , 175-187 (2007).
- Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
- Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
- Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
- Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
- Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
