प्रतिदीप्ति<em> बगल में</emवायरस और संयंत्र और कीट ऊतकों में एंडोसिम्बायोटक जीवाणु के स्थानीयकरण के लिए> hybridizations (मछली)
Summary
हम कीट और संयंत्र के ऊतकों में वायरस और बैक्टीरिया के स्थानीयकरण के लिए यहाँ स्वस्थानी संकरण में एक सरल प्रतिदीप्ति (मछली) विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल पूरे माउंट में mRNA के दृश्य और सूक्ष्म वर्गों के लिए बढ़ाया जा सकता है.
Abstract
सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति सामान्यतः कोशिकाओं में जीन टेप visualizing और आगे इस तरह के वायरस और बैक्टीरिया से संक्रमण के रूप में सेल में अन्य घटकों कल्पना करने के लिए संशोधित किया जा सकता है के लिए इस्तेमाल की तकनीक की एक किस्म को दिया नाम है. स्थानिक स्थानीयकरण और संक्रमण की प्रक्रिया के दौरान वायरस और बैक्टीरिया के दृश्य के विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में इस तरह के प्रोटीन और RNAseq के रूप में अभिव्यक्ति की रूपरेखा प्रयोगों का पूरक है कि एक आवश्यक कदम है. इन एजेंटों के साथ spatiotemporal संक्रमण को समझना सेलुलर घटकों के साथ उनकी बातचीत को समझने के उद्देश्य से जैविक प्रयोगों के पूरक. ऐसे पत्रकार जीन सिस्टम या immunohistochemical विधियों के रूप में वायरस और बैक्टीरिया दृश्यमान करने के लिए कई तकनीकों का समय लेने वाली है, और कुछ मॉडल जीवों के साथ काम करते हैं और जटिल तरीके में शामिल करने के लिए सीमित कर रहे हैं. सेल में शाही सेना या डीएनए प्रजातियों कि लक्ष्य मछली एक अपेक्षाकृत आसान और तेजी से मुझे हैजीन के spatiotemporal स्थानीयकरण के अध्ययन के लिए और नैदानिक प्रयोजनों के लिए thod. इस विधि मजबूत और प्रोटोकॉल विचार नहीं कर रहे हैं, जो कम hybridizing, वाणिज्यिक खरीदा जांच, रोजगार जब लागू करने के लिए अपेक्षाकृत आसान हो सकता है. नमूना तैयार करने, निर्धारण, संकरण, और सूक्ष्म दृश्य जटिल कदम शामिल नहीं है जब यह विशेष रूप से मजबूत है. यहाँ हम कीट और संयंत्र के ऊतकों में बैक्टीरिया और वायरस के स्थानीयकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. विधि उनके 5 'या 3' पर फ्लोरोसेंट रंगों संयुग्मित कम डीएनए जांच समाप्त होता है 20 आधार जोड़े के साथ सरल तैयारी, निर्धारण, और कीट पूरे mounts और विच्छेदित अंगों या हाथ से बनाया संयंत्र वर्गों के संकरण, पर आधारित है. इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक कीट और संयंत्र के ऊतकों की एक संख्या के लिए लागू किया गया है, और सेल में mRNAs या अन्य शाही सेना या डीएनए प्रजातियों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
उनके संक्रमित संयंत्र मेजबानों के साथ संयंत्र वायरस और अन्य रोगजनकों के बीच बातचीत का अध्ययन करते हैं, तो यह है कि वे अपने मेजबानों पर नकारात्मक प्रभाव के कारण चाहे, बगल में रोगजनकों और उनके संबंधित न्यूक्लिक एसिड कल्पना करने के लिए महत्वपूर्ण है. संयंत्र कोशिकाओं के भीतर और बीच रोगज़नक़ आंदोलन का अध्ययन करने पर यह सबसे महत्वपूर्ण है. रोगज़नक़ के जीन उत्पादों की सीटू स्थानीयकरण में pathogenicity प्रक्रिया के अध्ययन के लिए अन्य तरीकों का पूरक है कि एक आवश्यक कदम है. कई संयंत्र रोगजनकों, विशेष रूप से वायरस, उनके वैक्टर के साथ जटिल और अंतरंग बातचीत होने, कीड़ों से प्रेषित कर रहे हैं. उनके वैक्टर में इन वायरस के स्थानीयकरण प्रसारण के लिए पथ के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, और वेक्टर के अंदर संभव बातचीत साइटों. कुछ कीट vectored संयंत्र वायरस का संचरण इन कीड़ों के भीतर रहते हैं कि एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया द्वारा सहायता प्राप्त है. बेहतर ये संयंत्र वायरस बी के प्रसारण का अध्ययन करने के लिएउनके वैक्टर, यह सामान्य रूप में एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया कल्पना, और विशेष रूप से वायरस के संचरण में शामिल लोगों के लिए भी आवश्यक है y. वायरस और एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया की colocalization इस प्रकार अपने कीट मेजबान के भीतर इन जीवों के बीच संभावित संबंधों की जांच के लिए वांछित है. एक तरफ वायरस के संचरण से, एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया कीट वैक्टर के जीव विज्ञान के कई पहलुओं को प्रभावित, कीड़े के भीतर इन बैक्टीरिया की इस प्रकार स्थानिक स्थानीयकरण उच्च ब्याज और महत्व का है.
टमाटर पीला पत्ता कर्ल वायरस (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) दुनिया भर में 1-4 की खेती टमाटर का सबसे महत्वपूर्ण वायरल रोग जटिल है. TYLCV एक फ्लोएम सीमित वायरस है और विशेष रूप से whitefly Bemisia tabaci 5,6 द्वारा vectored है. उनके whitefly वैक्टर में begomoviruses के स्थानान्तरण का वर्णन एक मॉडल 6-9 प्रस्तावित किया गया है. दो विशिष्ट बाधाओं को सक्रिय रूप से dur पार कर रहे हैंआद्यमध्यांत्र / hemolymph और hemolymph / लार ग्रंथि बाधाओं: इस प्रसारता प्रसारण आईएनजी. इस संचरण प्रक्रिया वायरस capsid पहचान जो अज्ञात रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता किए जाने की परिकल्पना की है. TYLCV बी पार करने के लिए सोचा है यह संयंत्र में इंजेक्शन से पहले tabaci आद्यमध्यांत्र 6,10, और प्राथमिक लार ग्रंथि 6 के माध्यम से अवशोषित कर लेता है. Whitefly hemolymph में, TYLCV कीट माध्यमिक एंडोसिम्बायोटक जीवाणु Hamiltonella द्वारा उत्पादित एक GroEL प्रोटीन के साथ सूचना का आदान प्रदान. इस बातचीत hemolymph में TYLCV के सुरक्षित परिवहन सुनिश्चित करता है, और कीट प्रतिरक्षा प्रणाली 11. Hamiltonella और Portiera, प्राथमिक endosymbiont के हमले से बचाता है whiteflies की, bacteriocytes में रखे जाते हैं, hemolymph और घर एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया 11. बी में पाया कीट कोशिकाओं tabaci रिकेटसिआ, Arsenophonus, Wolbachia, और Fritsch सहित अतिरिक्त एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया बंदरगाहोंbacteriocytes अंदर या बाहर स्थानीय है, और किया जा सकता है जो ईए, कीट जीव विज्ञान 12 पर विविध प्रभाव है.
कई रिपोर्टों सूक्ष्म मोटी अनुभाग 10,13 पर बगल में इस तरह के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर), एंटीबॉडी और शाही सेना के रूप में समय लेने वाली और महंगा प्रोटोकॉल का उपयोग करके पौधों और whiteflies में TYLCV के स्थानीयकरण का अध्ययन करने का प्रयास किया है, हाल ही में एक अध्ययन स्थानीयकरण वर्णित एक सरल प्रोटोकॉल 14 का उपयोग करके अपने संयंत्र और वेक्टर मेजबान अंदर संयंत्र वायरस की. यहाँ हम बी में TYLCV का स्थानीयकरण के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन tabaci midguts और लार ग्रंथियों विच्छेदित और वर्गों में TYLCV संक्रमित पौधों से तैयार किया. हम आगे Portiera, बी के प्राथमिक endosymbiont का स्थानीयकरण वर्णन tabaci, और अपनी माध्यमिक endosymbionts Hamitonella, रिकेटसिआ और Arsenophonus. इस प्रोटोकॉल, लघु डीएनए जांच के प्रयोग पर आधारित है किfluorescently उनके 5 'अंत पर लेबल, और विशेष रूप से वायरल या बैक्टीरियल जीन दृश्यों में पूरक दृश्यों को संकरण कर रहे हैं. नमूना प्रसंस्करण अपेक्षाकृत आसान है और प्राप्त संकेत अत्यधिक विशिष्ट है. वर्णित प्रोटोकॉल उनके पौधे, पशु और कीट मेजबान में वायरस, बैक्टीरिया और अन्य रोगजनकों स्थानीय बनाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और आगे किसी भी ऊतक में mRNA स्थानीयकरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
अपने संयंत्र मेजबान और कीट वेक्टर में एक संयंत्र वायरस का स्थानीयकरण, और उनके विशिष्ट whitefly मेजबान में एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया के लिए यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल, पौधों और यहां तक कि जानवरों के ऊतकों मे?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ghanim प्रयोगशाला में अनुसंधान नहीं अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. जर्मन इजरायल फाउंडेशन (GIF) से 908-42.12/2006, कोई अनुदान. IS-4062-07 संयुक्त राज्य अमेरिका इसराइल Binational कृषि अनुसंधान और विकास कोष (चारण), और अनुसंधान अनुदान नहीं से. एमजी करने के लिए इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (ISF) से 884/07
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
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