Fluorescencia<em> In situ</em> Las hibridaciones (FISH) para la localización de los virus y las bacterias endosimbióticas en plantas e insectos tejidos
Summary
Se describe aquí un fluorescencia simple en la hibridación in situ (FISH) método para la localización de virus y bacterias en los tejidos de insectos y plantas. Este protocolo se puede ampliar para la visualización de mRNA en todo el montaje y secciones microscópicas.
Abstract
Fluorescencia de hibridación in situ (FISH) es un nombre dado a una variedad de técnicas comúnmente usadas para la visualización de las transcripciones de genes en células eucarióticas y se pueden modificar adicionalmente para visualizar otros componentes en la célula tales como la infección por virus y bacterias. Localización espacial y la visualización de los virus y bacterias durante el proceso de infección es un paso esencial que se complementa con los experimentos de perfiles de expresión como los microarrays y RNAseq en respuesta a diferentes estímulos. La comprensión de las infecciones espacio-temporales con estos agentes complementa experimentos biológicos destinados a la comprensión de su interacción con los componentes celulares. Varias técnicas para la visualización de virus y bacterias tales como sistemas de genes informadores o métodos inmunohistoquímicos son mucho tiempo, y algunos se limitan a trabajar con organismos modelo e implicar metodologías complejas. FISH que se dirige a especies de ARN o de ADN en la célula es una me relativamente fácil y rápidoDTO para el estudio de la localización espacio-temporal de los genes y para fines de diagnóstico. Este método puede ser robusto y relativamente fácil de implementar cuando los protocolos de hibridación emplean corto, sondas comercialmente comprados-, que no son caros. Esto es particularmente robusta cuando preparación de la muestra, la fijación, la hibridación, y la visualización microscópica no implican pasos complejos. Aquí se describe un protocolo para la localización de las bacterias y los virus en los tejidos de insectos y plantas. El método se basa en una preparación simple, la fijación, y la hibridación de montajes completos de insectos y órganos diseccionados o secciones de plantas hechas a mano, con 20 pares de bases de las sondas de ADN cortos conjugados con tintes fluorescentes en sus 5 'o 3'. Este protocolo se ha aplicado con éxito a un número de tejidos de insectos y plantas, y puede ser utilizado para analizar la expresión de ARNm o de otras especies de ARN o ADN en la célula.
Introduction
Cuando el estudio de las interacciones entre los virus de plantas y otros patógenos con sus huéspedes vegetales infectados, es importante visualizar los patógenos y sus respectivos ácidos nucleicos in situ, sin tener en cuenta si causan efectos negativos en sus anfitriones. Esto es más importante cuando se estudia el movimiento del patógeno dentro y entre las células de la planta. En localización in situ de productos de los genes del patógeno es un paso esencial que complementa otros enfoques para estudiar el proceso de patogenicidad. Muchos patógenos de las plantas, especialmente virus, son transmitidas por insectos, tener interacciones complejas e íntimas con sus vectores. La localización de estos virus en sus vectores es importante para el estudio de la ruta de acceso para la transmisión, y los posibles sitios de interacción dentro del vector. La transmisión de algunos virus de plantas por insectos es ayudado por las bacterias endosimbiontes que residen dentro de estos insectos. Para estudiar mejor la transmisión de estos virus de plantas by sus vectores, sino que también es esencial para visualizar las bacterias endosimbiontes en general, y los que participan en la transmisión del virus, en particular. Colocalización de los virus bacterias y endosymbiotic este modo deseado para investigar las posibles relaciones entre estos organismos dentro de su insecto hospedador. Aparte de la transmisión del virus, bacterias endosymbiotic influyen varios aspectos de la biología de los vectores de insectos, por lo tanto la localización espacial de estas bacterias dentro de insectos es de gran interés e importancia.
Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) es el complejo de la enfermedad viral más importante del tomate cultivado en todo el mundo 1-4. TYLCV es un virus floema limitado y recibe guía vectorial exclusivamente por la mosca blanca Bemisia tabaci 5,6. Un modelo que describe la translocación de begomovirus en sus vectores de mosca blanca se ha propuesto 6-9. Dos barreras específicas se cruzan de forma activa duranteing esta transmisión circulativa: el intestino medio / hemolinfa y las barreras de la glándula hemolinfa / salivales. Este proceso de transmisión se planteó la hipótesis de que es mediado por los receptores desconocidos que reconocen la cápside del virus. TYLCV se piensa para cruzar B. tabaci intestino medio de 6,10, y se absorbe a través de la glándula salival primaria 6 antes de que se inyecta en la planta. En la hemolinfa de la mosca blanca, TYLCV interactúa con una proteína GroEL producida por la bacteria endosimbiótica secundaria insecto Hamiltonella. Esta interacción garantiza un transporte seguro del TYLCV en la hemolinfa, y lo protege del ataque por el sistema inmune de insectos 11. Hamiltonella y Portiera, la endosymbiont primaria de la mosca blanca, se alojan en bacteriocytes, células de insectos que se encuentran en la hemolinfa y la casa endosymbiotic bacterias 11. B. tabaci alberga bacterias endosimbiontes adicionales como Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, y Fritschea, que pueden ser localizados dentro o fuera de los bacteriocytes, y tienen diversos efectos sobre la biología del insecto 12.
Varios informes han intentado estudiar la localización del TYLCV en plantas y moscas blancas mediante el uso de protocolos consumen mucho tiempo y costosos tales como Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM), anticuerpos y ARN in situ sobre la sección de espesor microscópico 10,13, un estudio reciente describió la localización de virus de plantas dentro de sus plantas hospederas y vectoriales usando un simple protocolo 14. Aquí se describe un protocolo sencillo para la localización de TYLCV en B. tabaci diseccionó midguts y las glándulas salivales, y en las secciones prepara a partir de plantas infectadas por el virus de la cuchara. Se describe además la localización de Portiera, el endosymbiont principal de B. tabaci, y sus endosimbiontes secundarios Hamitonella, Rickettsia y Arsenophonus. Este protocolo se basa en el uso de sondas de ADN cortos, quese etiqueta fluorescente en su extremo 5 ', y hibridarse específicamente a secuencias complementarias en las secuencias de genes virales o bacterianas. El procesamiento de la muestra es relativamente fácil y la señal obtenida es altamente específico. El protocolo descrito se puede utilizar para localizar virus, bacterias y otros patógenos en sus huéspedes vegetales, animales y de insectos, y se puede usar además para localizar ARNm en cualquier tejido dado.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí para la localización de un virus de planta en su huésped de la planta y los insectos vectores, y las bacterias endosymbiotic en su huésped de la mosca blanca específica, se puede adaptar para la localización de otros virus en plantas e incluso en los tejidos animales. Además, el protocolo se puede utilizar para localizar bacterias endosymbiotic y patógenos y otros microorganismos en sistemas de plantas y animales. Los métodos descritos se basan en el concepto simple de la hibridación…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación en el laboratorio de Ghanim fue apoyado por una beca de investigación no. 908-42.12/2006 de la Fundación alemana-israelí (GIF), concesión no. IS-4062-07 de la-Unidos Israel Fund Estados Binacional de Investigación Agrícola y Desarrollo (BARD), y la beca de investigación no. 884/07 de la Israel Science Foundation (ISF) de MG
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
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