Fluorescens<em> In situ</em> Hybridiseringar (FISH) för lokalisering av virus och endosymbiotiska Bakterier i växt-och insekts vävnader
Summary
Vi beskriver här en enkel fluorescens in situ hybridisering (FISH) metod för lokalisering av virus och bakterier i insekts-och växtvävnader. Detta protokoll kan utvidgas för visualisering av mRNA i hela berget och mikroskopiska sektioner.
Abstract
Fluorescens in situ-hybridisering (FISH) är ett namn som ges till en mängd olika tekniker som vanligen används för att visualisera gentranskript i eukaryotiska celler och kan modifieras ytterligare för att visualisera andra komponenter i cellen, såsom infektion med virus och bakterier. Rumslig lokalisering och visualisering av virus och bakterier under infektionsprocessen är ett viktigt steg som kompletterar expression profiling experiment såsom microarrays och RNAseq som svar på olika stimuli. Förstå Spatiotemporal infektioner med dessa medel kompletterar biologiska experiment som syftar till att förstå deras interaktion med cellulära komponenter. Flera tekniker för att visualisera virus och bakterier, såsom reportergen system eller immunhistokemiska metoder är tidskrävande, och en del är begränsade till att arbeta med modellorganismer och omfatta komplicerade metoder. FISH som riktar RNA-eller DNA species i cellen är en relativt enkel och snabb migThOD för studium spatiotemporal lokalisering av gener och för diagnostiska ändamål. Denna metod kan vara robust och relativt lätt att genomföra när de protokoll använder korta hybridisering, kommersiellt köpta sonder, som inte är dyrt. Detta är särskilt robust när provpreparering, fixering, hybridisering, och mikroskopisk visualisering inte innebär komplicerade steg. Här beskriver vi ett protokoll för lokalisering av bakterier och virus i insekts-och växtvävnader. Metoden bygger på enkel beredning, fixering och hybridisering av insekts hela fästen och dissekerade organ eller handgjorda anläggningsdelar, med 20 baspar korta DNA-sonder konjugerade till fluorescerande färger på sina 5 'eller 3' slutar. Detta protokoll har tillämpats framgångsrikt på ett antal insekter och växtvävnader, och kan användas för att analysera uttrycket av mRNA eller andra RNA-eller DNA-arter i cellen.
Introduction
Vid studie av samverkan mellan växtvirus och andra patogener med sina infekterade växtvärdar, är det viktigt att visualisera patogener och deras respektive nukleinsyror in situ, oavsett om de orsakar negativa effekter på deras värdar. Detta är det viktigaste när man studerar patogen rörlighet inom och mellan växtceller. In situ lokalisering av genprodukter av patogenen är ett viktigt steg som kompletterar andra metoder för att studera sjukdomsframkallande förmåga processen. Många växtpatogener, särskilt virus, som överförs av insekter, som har komplexa och intima samspel med sina vektorer. Lokalisering av dessa virus i deras vektorer är viktigt för att studera utvecklingen för överföring, och de möjliga interaktionsställen inuti vektorn. Överföringen av vissa insektsvektorväxtvirus underlättas av endosymbiotiska bakterier som finns inom dessa insekter. För att bättre studera överföring av dessa växtvirus by deras vektorer, är det också viktigt att visualisera endosymbiotiska bakterier i allmänhet, och de som är involverade i virusöverföring, i synnerhet. Colocalization av virus och endosymbiotiska bakterier är därför önskvärt för att undersöka möjliga samband mellan dessa organismer inom sina insekts värd. Bortsett från virusöverföring, endosymbiotiska bakterier påverkar flera aspekter av biologin av insekter, är alltså rumslig lokalisering av dessa bakterier inom insekter av stort intresse och betydelse.
Tomato Yellow Leaf Curl-viruset (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) är den viktigaste virussjukdom komplex av odlade tomater i världen 1-4. TYLCV är en floem begränsad virus och är uteslutande vektoriserade av vita flygare Bemisia tabaci 5,6. En modell som beskriver sloka av begomoviruses i sina vita flygare vektorer har föreslagits 6-9. Två särskilda hinder aktivt korsas underning denna circulative växellåda: midgut / hemolymfa och hemolymfa / spottkörtel barriärer. Denna transmissionsmekanismen är en hypotes som medieras av okända receptorer som känner igen viruset kapsiden. TYLCV tros passera B. tabaci midgut 6,10, och absorberas genom primära spottkörteln 6 innan det sprutas in i anläggningen. I whitefly hemolymfa, TYLCV interagerar med en GroEL protein som produceras av insekts sekundär endosymbiotisk bakterie Hamiltonella. Denna interaktion garanterar säker transport av TYLCV i hemolymfa, och skyddar den från angrepp av insektsimmunsystemet 11. Hamiltonella och Portiera den primära endosymbiont av vita flygare, är inrymda i bacteriocytes, insektsceller funna i hemolymfa och gatu endosymbiotiska bakterier 11. B. tabaci hyser ytterligare endosymbiotiska bakterier inklusive Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia och Fritschea, som kan vara lokaliserade inuti eller utanför de bacteriocytes, och har olika effekter på insektens biologi 12.
Flera rapporter har försökt att studera lokalisering av TYLCV i växter och vita flygare med hjälp av tidskrävande och kostsamma protokoll såsom transmissionselektronmikroskop (TEM), antikroppar och RNA in situ på mikroskopisk tjock avsnitt 10,13, beskrev en färsk undersökning lokaliseringen av växtvirus inuti deras växt-och vektor värdar genom att använda ett enkelt protokoll 14. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för lokalisering av TYLCV i B. tabaci dissekerade midguts och spottkörtlar samt i avsnitten framställs från TYLCV-infekterade plantor. Vi beskriver lokalisering av Portiera den primära endosymbiont av B. ytterligare tabaci, och dess sekundära endosymbionts Hamitonella, Rickettsia och Arsenophonus. Protokollet bygger på att använda korta DNA-sonder, somär fluorescensmärkt på sin 5'-ände, och specifikt hybridisera till komplementära sekvenser i virala eller bakteriella gensekvenser. Provet bearbetning är relativt lätt och den signal som erhålls är mycket specifika. Det beskrivna protokollet kan användas för att lokalisera virus, bakterier och andra patogener i deras växt-, djur-och insekts värdar, och kan vidare användas för att lokalisera mRNA i varje given vävnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här för lokalisering av ett växtvirus i sin växtvärd och insektsvektor och endosymbiotiska bakterier i deras specifika whitefly värd, kan anpassas för lokalisering av andra virus i växter och även i djurvävnader. Dessutom kan protokollet användas för att lokalisera endosymbiotiska och sjukdomsframkallande bakterier och andra mikroorganismer i växt-och djursystem. De beskrivna metoderna förlitar sig på enkelt koncept av hybridisering mellan en kort, fluorescensmärkt oligonukleotid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Ghanim labbet stöddes av forskningsanslag nr. 908-42.12/2006 från den tysk-israeliska Foundation (GIF), bevilja nej. IS-4062 till 07 från USA-Israel binationella jordbruksforskning och utvecklingsfonden (BARD), och forskningsanslag nr. 884/07 från Israel Science Foundation (ISF) till MG
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
References
- Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
- Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
- Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
- Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
- Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
- Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
- Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
- Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
- Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
- Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
- Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
- Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
- Ghanim, M., Medina, V., Czosnek, H. . Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. , 175-187 (2007).
- Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
- Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
- Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
- Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
- Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
