Funktionell analys av Larv Feeding Circuit i Drosophila</i

Summary

Matningskretsen i Drosophila melanogaster larver serverar en enkel men kraftfull modell som tillåter ändringar i matningshastighet som korreleras med förändringar i stomatogastric neurala kretsar. Denna krets består av centrala serotonerga nervceller som skickar prognoser till munnen krokar samt framtarmen.

Abstract

Den serotonerga matningskretsen i Drosophila melanogaster larverna kan användas för att undersöka neuronala substrat av avgörande betydelse under utvecklingen av kretsen. Använda funktionell utgång hos kretsen, utfodring, förändringar i neuronal arkitektur av stomatogastric systemet kan visualiseras. Ätbeteende kan spelas in genom att observera graden av indragning av munnen krokar, som får innervation från hjärnan. Motoriskt beteende används som en fysiologisk kontroll för utfodring, eftersom larver använda sina munnen krokar för att korsa över en agar-substrat. Förändringar i ätbeteende kan korreleras med den axonal arkitektur neurites innerverar tarmen. Använda immunohistokemi är det möjligt att visualisera och kvantifiera dessa förändringar. Felaktig hantering av larverna under beteende paradigm kan ändra uppgifter som de är mycket känsliga för manipulationer. Korrekt avbildning av neurite arkitektur innervatingtarmen är kritisk för exakt kvantifiering av antalet och storleken på varicosities liksom omfattningen av förgreningsnoder. Analys av de flesta kretsar tillåter endast för visualisering av neurite arkitektur eller beteendeeffekter, men gör denna modell en att korrelera den funktionella utgången på kretsen med de försämringar i neuronal arkitektur.

Introduction

Drosophila är en extremt kraftfull modellsystem för att studera neurala kretsutveckling på grund av snabb generationstid, låg experimentell kostnad, och förmågan att manipulera och kontrollera genetiska och miljömässiga faktorer. Neurogenes, neuronal väg fynd och synaptogenesis är konserverade mellan människor och Drosophila, därför mekanismerna i att skapa, underhålla och modifiera nervbanor bevaras också.

Klassiska signalsubstanser, som serotonin (5-hydroxitryptamin eller 5-HT) kan fungera som tillväxtfaktorer innan den antar sina roller som signalmolekyler i den mogna neurala kretsen ^1-3 Tidigare studier har visat att perturbed nivåer av 5-HT under fosterutvecklingen förändrar anslutning av mogna nervceller ^4. Andra har visat att ektopisk applicering av 5-HT till odlade Helisoma neuroner trycka neuritutväxt liksom synaptogenesis ^5-7. I Drosophila är utvecklingsstörningar 5-HT-nivåer omvänt relaterade till varicosity antal och storlek, såväl som graden av aborization, utmed längden av neuriter utskjutande till framtarmen från CNS ^8.

Serotonerg neurotransmission har visats modulera matnings beteenden i olika arter, inklusive Drosophila ^8-9. Matningskretsen i Drosophila är en relativt enkel krets som kan användas som en modell för att korrelera funktionsutgång (matning) med förändringar i utvecklingen av axonal prognoser från hjärnan till framtarmen. Schoofs et al. har visat att Drosophila larver utfodring regleras av centrala mönsterritare som påverkar muskulatur ^10. Medan den specifika muskel anatomi inte är fullständigt förstådd, har det visats att den antenn nerv, maxillary nerve, och prothoracic tillbehöret nerv är ansvariga för de muskulära mål som är inblandade iätbeteende. De flesta uppgifter som innefattar muskulatur och nerv anatomi ryggradslösa utfodring är begränsad till Calliphora larver.

Den matningshastighet för andra stadiets larver kan bedömas genom indragning av de cephalopharyngeal sclerites (mun krokar), och är reproducerbar och hög genomströmning. De cephalopharyngeal plattorna är innerveras av fibrer från centrala 5-HT-neuron via främre nerven. Den proventriculus eller framtarmen, innerveras av serotonerga fibrer (recurrens nerv) som fasciculate i midgut och är ansvariga för sammandragningar framtarmen (Figur 1) ^{från 11 till 12.} Förändringar i axonal förgrening, och antalet och storleken på varicosities längs neurite längd, kan kvantifieras med hjälp av immunhistokemiska tekniker. Manipulera neuronala 5-HT under utveckling, antingen direkt eller indirekt, kan ändra den funktionella produktionen av denna matningskrets, som kan bedömas och korrelerad med förändringar i morphology av neurite arkitektur.

Protocol

1. Underhåll av Befolknings Burar Bibehåll populations burar vid 25 ° C på en 12 h ljus-mörker-cykel. Så länge som styr-och experimentgrupperna är utsatta för samma ljusförhållanden, då kan utföras av denna teknik i en standard laboratoriemiljö. Låt honor att lägga ägg över natten på äppeljuice-agarplattor. Samla nykläckta larver genom att upprätthålla plattor med nyligen deponerade ägg vid 25 ° C under 24 timmar. Placera en liten klick av jäst i mitten av plattan…

Representative Results

Den serotonergiska matarkrets i Drosophila larv kan fungera som en extremt effektiv modell för att observera inverkan av vissa faktorer på nervsystemets utveckling. Genom kvantifiering av matningshastigheten, är det möjligt att koppla axonal arkitektur av matningskretsen med dess funktionella utgång (fig 1). Den rörelseanalys används som en fysiologisk kontroll för indragningar av munnen krokar, eftersom larver använda sina munnen krokar för att driva sig över ytan av agar. Det bör …

Discussion

Avvikande utveckling av det serotonerga stomatogastric krets, vilket sker under sen embryogenes, kommer att påverka dess mogna funktion. Förändringar i neurite arkitektur innerverar tarmen kan korreleras med den funktionella utmatningen från kretsen, vilken är matningshastigheten (mätt genom mun krok sammandragningar i en jästlösning) (Figur 1). Användningen av UAS-Gal4 tvåparts systemet i Drosophila gör det möjligt att specifikt rikta upp-eller ned-reglerade expressionen av en give…

Materials

Eclipse E-800 Microscope	Nikon Instruments
Neuroleucida	MBF Biosciences	NL-15	Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have
Northern Eclipse	Empix Inc		Imaging software
G-2E/C TRITC EX 528-553	Nikon Instruments	96312	Filter for specific secondary antibody
N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded	Nikon Instruments	MRH00400	Objective used for imaging
Simple Neurite Tracer	NIH Image J		http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer