Gransker effekten av Probiotika på Pneumokokk Colonization Bruke en<em> In Vitro</em> Overholdelse analysen

Summary

In vitro assays tilslutning kan brukes til å studere festingen av Streptococcus pneumoniae til epitel cellemonolagene og for å undersøke mulige intervensjoner slik som bruk av probiotika for inhibering av pneumokokk kolonisering.

Abstract

Overholdelse av Streptococcus pneumoniae (pneumococcus den) til epiteliale slimhinnen i nasopharynx kan resultere i koloniseringen, og er ansett som en forutsetning for pneumokokkinfeksjoner som lungebetennelse og otitis media. In vitro tilslutning assays kan anvendes for å studere festingen av pneumokokker til epitel celle monolag, og for å undersøke mulige intervensjoner, slik som bruk av probiotika, for å inhibere pneumokokk-kolonisering. Den protokoll som er beskrevet her, brukes for å undersøke effekten av probiotisk Streptococcus salivarius på vedheftningen av pneumokokker til human epitelial cellelinje CCL-23 (noen ganger referert til som HEp-2-celler). Analysen omfatter tre hovedtrinn: 1) Fremstilling av epitel-og bakterieceller, 2) tilsetningen av bakterier til epiteliale cellemonolagene, og 3) påvisning av vedheftende pneumokokker av levedyktige tellinger (seriell fortynning og plating) eller kvantitativ real-time PCR (qPCR ). Dette technique er relativt enkel og krever ikke spesialutstyr annet enn et oppsett vev kultur. Analysen kan brukes til å teste andre probiotiske arter og / eller potensielle hemmere av pneumokokk kolonisering og kan enkelt endres for å løse andre vitenskapelige spørsmål om pneumokokk etterlevelse og invasjon.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (den pneumococcus) er en Gram positiv bakterie som kan forårsake infeksjoner, inkludert lungebetennelse, ørebetennelse media, og hjernehinnebetennelse. Det er en viktig årsak til sykdom hos barn i lavinntektsland og ansvarlig for anslagsvis 800 000 dødsfall av barn under fem år hvert år ^en. Pneumokokker blir ofte utført i nasopharynx av små barn. Selv om denne kolonisering er generelt ansett asymptomatisk, forut for det pneumokokkinfeksjon, og tjener som et reservoar for bakteriene i humane populasjoner ^2. Pneumokokk konjugatvaksine vaksinasjon reduserer effektivt tang av serotyper som finnes i vaksinen. Det er imidlertid mer enn 90 pneumokokk-serotyper, og vaksinering kan føre til serotype utskifting, hvorved eliminering av vaksineserotypene er etterfulgt av en økning i vognen og sykdom forårsaket av nonvaccine serotyper ^3. Også i enkelte høyrisikopopulasjoner, pneumokokkkolonisering ofte oppstår svært tidlig i livet, før administrasjon av den første vaksinedosen ^4,5. Nylig har anvendelse av probiotika vært foreslått som en ytterligere strategi for å inhibere pneumokokk-kolonisering ^6,7. In vitro assays tilslutning er blitt brukt til å undersøke pneumokokk tilslutning ^8,9. Disse analysene har blitt tilpasset for å undersøke virkningen av probiotiske Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) på pneumokokk etterlevelse ^10.

I tillegg til LGG og andre melkesyrebakterier, Streptococcus salivarius, en vanlig person bosatt i munnhulen, er blitt undersøkt som en potensiell probiotisk for luftrøret på grunn av sin kolonisering potensial og evne til å hemme pneumokokker og andre respiratoriske patogener in vitro ^{11 – 13.} Protokollen presenteres her beskriver en tilslutning test som benyttes for å undersøke effektene av S. salivarius K12 på pneumokokk etterlevelsetil human epitelial cellelinje CCL-23. Før bruk i analysen, ble pneumokokkisolatene evaluert for etterlevelse evner, som vekst og overholdelse egenskaper kan variere betydelig mellom isolatene ^10,14. Vekstkurver av pneumokokker og S. salivarius ble utført for å bestemme mid-log-fase-og estimat-konsentrasjon (kolonidannende enheter eller CFU / ml) av optisk tetthet (OD, fig 1). Det anbefales å undersøke veksten av levedyktig telling og OD for hver isolere før anvendelse i analysen. Denne analysen kan utføres i ethvert laboratorium med standard vevskultur anlegg og utstyr. I denne protokollen, effekten av tre doser av S. salivarius administrert 1 time før tilsetning av pneumokokker på vedheftningen av S. pneumoniae PMP843, en serotype 19F vogn isolat avledet fra en nasofaryngeal pinne, blir undersøkt. To forskjellige måter å kvantifisere tilhenger pneumokokker presenteres: plating på blodagar å avskrekkegruven levedyktige teller, og DNA-ekstraksjon og påvisning av pneumokokk Lyta genet ved qPCR ^15. Den grunnleggende tilslutning analyseprotokollen kan enkelt endres til å teste forskjellige doser eller tidspunkt for inntak av probiotika og kan også brukes med andre bakteriestammer eller arter.

Protocol

En. Utarbeidelse av epithelial og bakterieceller Tining av CCL-23 epitelceller Prewarm Minimum Essential Media (MEM) inneholdende 10% kalvefosterserum (FBS) i et 37 ° C vannbad i ~ 30 min. Steril vevet kultur-godkjent biosikkerhet kabinett med UV-lys i minst 10 minutter før bruk, og tørk av arbeidsområdet med 70% etanol. Tørk den varmet media flaske med 70% etanol og sted i biosikkerhet kabinett. Ved hjelp av en 25 ml pipette, overføre 14 ml av media inn i e…

Representative Results

Resultatene fra et representativt eksperiment hvor pneumokokker (S. pneumoniae PMP843, en kolon 19F isolat) ble tilsatt til CCL-23 cellene i 1 time etter at tilsetningen av S. salivarius, og pneumococcal tilslutning ble kvantifisert ved både levedyktig telling og Lyta qPCR er vist i tabell 2.. Resultatene var i overensstemmelse mellom de to metodene for både den absolutte antall bakterier (presentert som CFU / ml), og% tilslutning, normalisert til antallet av vedheftende pne…

Discussion

En viktig del av denne analysen er å legge de passende konsentrasjoner av S. salivarius og pneumokokker i avsnitt 3.1.7 og 3.1.12. Konsentrasjonene er beregnet ved hjelp av OD-målinger, men den nøyaktige inokulater bestemmes ikke før platene telles neste dag. Av denne grunn anbefales det å utføre vekstkurver for å måle OD og levedyktige tellinger (CFU / ml) over tid for alle bakteriestammer som benyttes i analysen, for å identifisere den mid-log-fase og hjelpe til med å estimere konsentrasjonen av OD….

Materials

Minimum Essential Media (MEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30244.01
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30084.03
T-75 Flask	Nunc	156472
CCL-23 cells	ATCC	CCL-23
Trypsin	Life Technologies	15090046
24-well cell culture plate	Nunc	142475
Horse blood agar (HBA) plates	Oxoid	PP2001	Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth	Oxoid	CM0189
Yeast Extract	Beckton Dickinson	212750
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Disposable cuvettes	Kartell	1938
Heparin	Pfizer	2112105	comes in sterile ampules at 5,000IU/5mL
sterile spreader	Technoplas	S10805050	alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
Mutanolysin	Sigma-Aldrich	M9901
Proteinase K	Qiagen	19133
SDS 20% solution	Ambion	AM9820
RNase A	Qiagen	19101
QIAamp DNA mini-kit (250)	Qiagen	51306
LytA F primer	Sigma-Aldrich	Custom made	5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer	Sigma-Aldrich	Custom made	5' -> 3' sequence TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe	Eurogentec	Custom made	5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water	Ambion	AM9906
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix	Agilent Technologies	600880
Thermo-Fast 96 Detection plate	Thermo Fisher Scientific	AB-1100
Ultra clear qPCR cap strips	Thermo Fisher Scientific	AB-0866
Mx3005 QPCR System	Agilent Technologies	401449
* alternative sources are available for most/all products listed