Исследование действия пробиотиков на пневмококковой колонизации Использование<em> Экстракорпоральное</em> Соблюдение Анализ
Summary
В пробирке приверженности анализы могут быть использованы для изучения прикрепление стрептококковой пневмонии на эпителиальные монослоев клеток и исследовать потенциальные вмешательства, такие как использование пробиотиков для ингибирования пневмококковой колонизации.
Abstract
Приверженность пневмококк (пневмококк) в эпителиальной выстилки носоглотки может привести к колонизации и считается необходимым условием для пневмококковых инфекций, таких как пневмония и отит. В пробирке приверженности анализы могут быть использованы для изучения прикрепление пневмококков к эпителиальных клеток монослои и исследовать возможных мер, таких как использование пробиотиков, ингибирует колонизацию пневмококковой. Протокол, описанный здесь используется, чтобы исследовать влияние пробиотического Streptococcus salivarius на адгезию пневмококков к человеческому эпителиальной клеточной линии CCL-23 (иногда называют Нер-2 клеток). Анализ включает в себя три основных этапа: 1) подготовка эпителиальных и бактериальных клеток, 2) добавление бактерий эпителиальных клеток монослоя, и 3) обнаружение спаечного пневмококков по жизнеспособных микроорганизмов (серийного разведения и посева) или количественной ПЦР в реальном времени (КПЦР ). Это TEChnique относительно проста и не требует специального оборудования, кроме установки для культуры ткани. Анализ может быть использован для тестирования других пробиотических видов и / или потенциальных ингибиторов пневмококковой колонизации и могут быть легко изменены для решения других научных вопросов, касающихся пневмококковой приверженности и вторжения.
Introduction
Пневмококк (пневмококк) является грамположительных бактерий, которые могут вызвать инфекции в том числе пневмонии, отита и менингита. Это является основной причиной заболевания у детей в странах с низким доходом и ответственность за предполагаемые 800,000 смертей детей в возрасте до пяти в год 1. Пневмококки часто проводятся в носоглотке детей младшего возраста. Хотя это колонизация как правило, считается бессимптомно, она предшествует пневмококковой инфекции и служит резервуаром для бактерий в популяциях человека 2. Пневмококковой конъюгированной вакцинация эффективно снижает перевозку серотипов, содержащихся в вакцине. Тем не менее, существует более 90 серотипов пневмококка, и вакцинация может привести к замене серотипа, при этом ликвидация серотипов вакцины сопровождается повышением перевозки и болезней, вызываемых невакцинных серотипов 3. Кроме того, в некоторых группах высокого риска, пневмококковаяколонизация часто происходит в самом начале жизни, до введения первой дозы вакцины 4,5. В последнее время использование пробиотиков был предложен в качестве дополнительного стратегии ингибировать пневмококковой колонизации 6,7. В пробирке приверженности анализы были использованы для изучения пневмококковой присоединение 8,9. Эти анализы были адаптированы для исследования воздействия пробиотиков Lactobacillus Rhamnosus GG (LGG) на пневмококковой приверженности 10.
В дополнение к LGG и других молочнокислых бактерий, Streptococcus salivarius, общий житель полости рта, была исследована в качестве потенциального пробиотика для дыхательных путей из-за его потенциальной колонизации и способностью ингибировать пневмококков и других респираторных патогенов в пробирке 11 – 13. Протокол, представленные здесь описывает приверженности анализа, используемый для исследования эффектов S. salivarius K12 на пневмококковой приверженностик человеческому эпителиальной клеточной линии CCL-23. Перед использованием в анализе, пневмококковых изолятов были оценены для возможности придерживания, как рост и адгезия может существенно меняться в зависимости от изолятов 10,14. Кривые роста пневмококков и S. salivarius проводились для определения середины логарифмической фазы и концентрацию оценка (колониеобразующих единиц или КОЕ / мл) по оптической плотности (OD, рисунок 1). Рекомендуется изучить рост, количество жизнеспособных и ОД для каждого изолята до использования в анализе. Этот анализ может быть выполнен в любой лаборатории с помощью стандартных средств для культивирования тканей и оборудования. В этом протоколе, последствия трех доз S. salivarius вводили за 1 час перед добавлением пневмококков на адгезию S. пневмонии PMP843, серотип 19F перевозки изолят, полученный из носоглотки тампоном, рассматриваются. Существует два различных способа количественно приверженцем пневмококки представлены: покрытие на кровяной агар для сдерживаниямой жизнеспособные счету, и добыча и обнаружение пневмококковой гена Лита по кПЦР 15 ДНК. Основной протокол анализ присоединение может быть легко модифицирована, чтобы проверить различные дозы или время введения пробиотиков, а также может быть использован с другими бактериальными штаммами или видов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критическая часть этого анализа, добавив соответствующие концентрации S. salivarius и пневмококки в разделах 3.1.7 и 3.1.12. Концентрации оцениваются с использованием показаний OD но точная посевной не определены, пока пластины не подсчитываются на следующий день. По этой причине, мы рекомен…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансирование из Мердока Детский научно-исследовательского института и Оперативной программы Инфраструктура поддержки викторианской правительства.
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30244.01 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30084.03 | ||
| T-75 Flask | Nunc | 156472 | ||
| CCL-23 cells | ATCC | CCL-23 | ||
| Trypsin | Life Technologies | 15090046 | ||
| 24-well cell culture plate | Nunc | 142475 | ||
| Horse blood agar (HBA) plates | Oxoid | PP2001 | Sheep blood agar plates also acceptable | |
| Todd-Hewitt Broth | Oxoid | CM0189 | ||
| Yeast Extract | Beckton Dickinson | 212750 | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | ||
| Disposable cuvettes | Kartell | 1938 | ||
| Heparin | Pfizer | 2112105 | comes in sterile ampules at 5,000IU/5mL | |
| sterile spreader | Technoplas | S10805050 | alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ||
| Mutanolysin | Sigma-Aldrich | M9901 | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| SDS 20% solution | Ambion | AM9820 | ||
| RNase A | Qiagen | 19101 | ||
| QIAamp DNA mini-kit (250) | Qiagen | 51306 | ||
| LytA F primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA | |
| LytA R primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT | |
| LytA probe | Eurogentec | Custom made | 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9906 | ||
| Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix | Agilent Technologies | 600880 | ||
| Thermo-Fast 96 Detection plate | Thermo Fisher Scientific | AB-1100 | ||
| Ultra clear qPCR cap strips | Thermo Fisher Scientific | AB-0866 | ||
| Mx3005 QPCR System | Agilent Technologies | 401449 | ||
| * alternative sources are available for most/all products listed | ||||
References
- O’Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
- Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
- Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
- Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
- Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
- Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
- Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
- Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
- Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
- Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
- Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
- Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
- Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
- Carvalho, M. d. G. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
- Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
- Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
- Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).
