Vi beskriver en protokol til måling af den antivirale cytokinproduktion i mus inficeret med en model herpesvirus murin gamma herpesvirus 68 (γ HV68), som er nært beslægtet med human Kaposis sarkom-associeret herpesvirus (KSHV) og Epstein-Barr virus (EBV). Ved hjælp af genetisk modificerede mus stammer og muse embryonale fibroblaster (MEF), vurderede vi det antivirale cytokinproduktion både in vivo og ex vivo. "Tilberedning" udtryk for medfødte immunforsvar komponenter i knockout embryofibroblaster ved lentiviral transduktion, vi yderligere lokalisere specifikke medfødte immunforsvar molekyler og dissekere de centrale signalsystemer begivenheder, der differentielt regulerer det antivirale cytokin produktion.
Som svar på en viral infektion, er svartiden værten medfødte immunsystem aktiveres til at opregulere genekspression og produktion af antivirale cytokiner. Omvendt har vira udviklet indviklede strategier til at unddrage sig og udnytte vært immun signalering for overlevelse og formering. Viral immun unddragelse, medfører vært forsvar og viral svig, giver en af de mest fascinerende og dynamiske grænseflader at skelne samspillet host-virus. Disse undersøgelser fremme vores forståelse medfødte immunsystem regulering og bane vores måde at udvikle nye antivirale behandlinger.
Murine γHV68 er en naturlig patogen af murine gnavere. γHV68 infektion af mus giver en medgørlig lille dyremodel til at undersøge det antivirale respons på menneskelig KSHV og EBV som forstyrrelse af in vivo virus-værts interaktioner er ikke relevant. Her beskriver vi en protokol til at bestemme det antivirale cytokin produktion. Denne protokol kan tilpasses til andre virbruger og signalveje.
For nylig har vi opdaget, at γHV68 kaprer Mavs og IKKβ, centrale medfødte immun signalering komponenter nedstrøms for den cytosoliske RIG-I og MDA5 at ophæve NFkB aktivering og antivirale cytokin produktion. Specifikt γHV68 infektion aktiverer IKKβ og aktiveret IKKβ phosphorylerer RelA at fremskynde RelA nedbrydning. Som sådan γ HV68 effektivt afkobler NFkB aktivering fra sin upstream aktiveret IKKβ, at bevirke antivirale cytokin genekspression. Denne undersøgelse belyser en indviklet strategi, hvorved det opstrøms medfødte immun aktivering opfanges af en viral patogen at ophæve den umiddelbare downstream transkriptionsaktivering og unddrage antiviral cytokinproduktion.
Nylige undersøgelser har skitseret de overordnede signalleringskaskader i montering vært medfødte immunrespons. Bosat i særskilte rum, mønstergenkendelse receptorer (PRRS) opdage patogen-associerede molekylære mønstre (PAMPs) af forskellig oprindelse til at udløse medfødte immunforsvar signalering 1. Den retinsyre-induceret gen I (RIG-I) og modermærkekræft differentiering antigen 5 (MDA5) proteiner er cytosoliske sensorer, der genkender RNA arter med særlige strukturelle træk 2. Ved aktivering RIG-I interagerer med sine downstream Mavs (også kendt som IPS-1, VISA, og Cardif) adapter, der til gengæld aktiverer IKK (IKKαβγ) og IKK-relateret kinase (TBK1 og IKKε, også kendt som IKKI )-komplekser 3-6. Aktiveret medfødte immunforsvar kinaser phosphorylerer vigtige regulatorer af genekspression, herunder transkriptionsfaktorer og inhibitorer deraf og muliggøre transkriptionsaktivering vært antivirale gener (f.eks IL6, TNF & #945,, CCL5 og IFNp). Disse signaleringskaskader udgør potente iboende medfødte immunrespons, der etablerer en anti-mikrobiel tilstand for at begrænse patogen udbredelse i de tidlige stadier af infektionen.
Murine γHV68 er nært beslægtet med den menneskelige onkogene KSHV og EBV. Således γHV68 infektion af mus giver en medgørlige lille dyremodel til at undersøge værtens immunrespons gamma herpes virus infektion in vivo 7. Brug γHV68 har vores laboratorium afsløret en indviklet strategi, hvorved γHV68 kaprer vært medfødte immunforsvar signalering at aktivere virusinfektion. På den ene side γHV68 aktiverer Mavs-IKKβ vej til fremme viral transkriptionel aktivering via dirigere aktiveret IKKβ phosphorylere replikation transaktivator (RTA), den virale transkriptionsfaktor nøgle til γHV68 replikation 8. På den anden side IKKβ-medieret phosphorylering primer RelA for nedbrydning og sigtinates NFkB aktivering 9. Som sådan γHV68 infektion effektivt undgår antiviral cytokinproduktion. Interessant, en screening udnytte et udtryk bibliotek af γHV68 identificerede RTA som en E3 ligase at fremkalde RelA nedbrydning og ophæver NFkB aktivering 10. Disse resultater afdække en indviklet immun unddragelse strategi, hvor upstream immun signalering begivenheder er udnyttet af γHV68 at negere den ultimative antivirale cytokin produktion.
Her beskriver vi en protokol til at måle det antivirale cytokin produktion i mus inficeret med γHV68 både in vivo og ex viv o. I protokollen vi yderligere at udforske "rekonstitueret" ekspression af medfødte immun komponenter knockout embryofibroblaster af lentiviral transduktion, som belyser funktionen af de specifikke medfødte immunmolekyler regulere antivirale cytokinproduktion. Denne protokol kan let tilpasses til andre ViruSES og signalveje.
Viral immun unddragelse er en af de mest dynamiske og fascinerende samspil interface viral lovovertrædelse og vært forsvar 9. Værten medfødte immunforsvar komponenter er struktureret sådan, at signaltransduktion effektivt initieres og trofast videregivet. Afgrænse hierarkiet og regulering af signalering kaskader er en fremtrædende emne for medfødte immunitet. Her introducerer vi en protokol til at identificere de regulatoriske roller en medfødt immun komponent, Mavs, i viral unddragelse af cytokin pr…
The authors have nothing to disclose.
Wild-type (Mavs + / +) og knockout (Mavs – / -)-mus, Wild-type (Mavs + / +) og knockout (Mavs – / -), blev MEF'er venligst leveret af Dr. Zhijian J. Chen (University of Texas Southwestern Medical Center) 13.. Denne publikation er baseret på arbejde finansieret af tilskud fra NIH (R01 CA134241 og R01 DE021445) og American Cancer Society (RSG-11-162-01-MPC).