Protokoll for forplantning av dissosierte høyverdige glioma kirurgiske prøver i serumfri nevrosfære medium for å velge for celler med kreft stamcelle fenotype. For prøver som ikke vokser som nevrosfærer, foreslås en alternativ protokoll. En parafininnbyggingsteknikk for å opprettholde 3D-nevrosfærens arkitektur for immunocytokjemi er beskrevet.
Glioblastomer, den vanligste og aggressive formen for astrocytoma, er ildfaste mot terapi og molekylært heterogene. Evnen til å etablere cellekulturer som bevarer foreldresvulstenes genomiske profil, til bruk i pasientspesifikke in vitro- og in vivo-modeller, har potensial til å revolusjonere den prekliniske utviklingen av nye behandlinger for glioblastom skreddersydd til de molekylære egenskapene til hver svulst.
Fra og med friske høyverdige astrocytomtumorer dissosiert i enkeltceller, bruker vi nevrosfærens analyse som en berikelsesmetode for celler som presenterer kreft stamcelle fenotype, inkludert uttrykk for nevrale stamcellemarkører, langsiktig selvfornyelse in vitro, og evnen til å danne ortotopiske xenografte svulster. Denne metoden er tidligere foreslått, og er nå i bruk av flere etterforskere. Basert på vår erfaring med dissosierende og kultiverende 125 glioblastomprøver, kom vi frem til den detaljerte protokollen vi presenterer her, egnet for rutinemessig nevrosfærekultur av høyverdige astrocytomer og storskala utvidelse av tumorogene celler for prekliniske studier. Vi rapporterer om effektiviteten av vellykkede langsiktige kulturer ved hjelp av denne protokollen og foreslår rimelige alternativer for å dyrke dissosierte glioblastomceller som ikke vokser som nevrosfærer. Vi beskriver også i detalj en protokoll for å bevare nevrosfærene 3D-arkitektur for immunhiistokjemi. Cellekulturer beriket i CSC-er, som er i stand til å generere ortotopiske xenograftmodeller som bevarer molekylære signaturer og heterogenitet av GBMs, blir stadig mer populære for studiet av biologien til GBMs og for forbedret design av preklinisk testing av potensielle terapier.
Glioblastom (GBM), en WHO grad IV astrocytoma, er den mest utbredte og aggressive primære hjernesvulsten. Ulike utviklingsfenotyper er vedtatt av GBM tumorceller, inkludert celler som viser “kreft stamcelle” (CSC) egenskaper, for eksempel uttrykk for nevrale stamcellemarkører (NSC), langsiktig selvfornyelse, og potensialet til å gi opphav til mer differensierte celler som uttrykker astrocytiske markører og danner hoveddelen av svulsten1-3. Mens avklaring fortsatt er nødvendig angående CSC molekylær identitet og kliniske implikasjoner, er fokuset i det nåværende arbeidet på den operative definisjonen av CSC: langsiktig selvfornyelse in vitro og evnen til å skille og reprodusere den opprinnelige svulsten ved ortotopisk implantasjon hos immunkompromitterte gnagere.
Glioblastomceller har blitt dyrket i flere tiår i tradisjonelt medium som inneholder 10% føtal bovint serum (FBS) og flere høyt passasje kommersielt tilgjengelige serumkulturerte GBM-cellelinjer er tumorogene i immunkompromitterte gnagere, men det er betydelig genomisk og molekylær divergens fra den opprinnelige svulsten4, noe som begrenser bruken som klinisk relevante modeller. Mer nylig ble celler med stam/stamcelle fenotype responsive til EGF og bFGF identifisert i GBMs2. Deretter ble dissosierte GBM tumorprøver dyrket i et serumfritt medium3, opprinnelig formulert for valg og utvidelse av nevrale stamceller fra den voksne pattedyrhjernen5. Disse kulturforholdene hindrer veksten av de fleste ikke-neoplastiske og mer differensierte tumorcellepopulasjoner, samtidig som de favoriserer veksten av stam- og stamceller som flytende multicellulære sfæroider, eller nevrosfærer3, etterligner oppførselen til voksne pattedyr nevrale stamceller5. Omfattende sammenligning side om side av primære GBM-celler dyrket i enten nevrosfæremedium supplert med vekstfaktorer (NMGF) eller i det tradisjonelle vekstmediet supplert med 10% FBS, avslørte at GBM-nevrosfærene var tumorigene, presenterte multilineage differensieringspotensial, og bevarte genotypen til den opprinnelige svulsten, i motsetning til de 10% FBS-kulturene som ikke var tumorogene ved lave passasjer og betydelig divergert fra de opprinnelige svulstene ved sene passasjer4.
Isolering av CSC fra dissosierte GBM-svulster etter cellesortering basert på uttrykket av putativ CSC-markør CD133 er også foreslått6,7, men videre arbeid indikerte at CSC-fenotypen ikke er definitivt forbundet med uttrykket av slike markører8-10, og reduserer den første entusiasmen for denne strategien, mens nye markører fortsatt blir testet10. Utilgjengeligheten til dags dato av et validert sett med markører som definerer CSC, sammen med målet om storskala forsterkning av disse cellene for prekliniske studier, gjør bruken av cellesortering upraktisk for rutinemessige CSC-berikede kulturer. GBM-celler valgt av evnen til å vokse som nevrosfærer i NMGF uttrykker alltid nevrale stamcellemarkører. Vi har observert at Sox2 og nestin er allestedsnærværende uttrykt i nevrosfærekulturer, mens CD133-protein er til stede i et delsett av GBM-nevrosfærene (upubliserte data og referanse11).
Flere laboratorier forfølger nevrosfærekulturer fra glioblastomtumorer ved hjelp av samme generelle tilnærming til enzymatisk dissosiasjon og kultivering i serumfritt medium supplert med vekstfaktorer3,4,11-14, mens andre kolleger har rapportert forsøk på å vokse langsiktige nevrosfærekulturer fra GBM-prøver uten suksess . Den generelle metoden for enzymatisk dissosiasjon og nevrosfærekultur av høyverdige gliomer presentert her ligner det som er skissert i de ovennevnte publikasjonene. Vi har optimalisert protokollen basert på vår erfaring med å dissosiere og dyrke over 100 GBM-prøver. Effektiviteten av å skaffe langsiktige nevrosfærekulturer fra ferske GBM-prøver som bruker protokollen som presenteres her, er over 40%, lik de få rapportene som viser effektivitetsdata3,15, noe som fører til utforskning av alternative protokoller som kultivering av celler kontinuerlig eller periodisk i serumfritt medium i nærvær av EGF og bFGF som monolayers på overflater belagt med ECM-protein16,17. Neurosphere kulturer er fortsatt den mest validerte og stadig mer populære tilnærmingen til å bevare GBM svulster molekylære egenskaper og tumorigent potensial3,4,11-14, dermed vår tilnærming er å forsøke nevrosfærer kulturer først, mens samtidig teste alternative metoder for å kultivere GBM celler som ikke klarer å danne langsiktige selvfornyende nevrosfærer ( Figur1), for å øke representasjonen av GBM svulster som kan brukes i dyremodeller. Her presenterer vi en protokoll for dyrking av nevrosfærer fra GBM-er. For celler som ikke klarer å danne nevrosfærer, viser vi en enkel modifikasjon i vekstmediet, som det første forsøket på å dyrke tumorogene celler fra ikke-urosphere som danner GBMs, med lovende resultater og fortsatt gjennomgår omfattende validering.
Riktig enzymatisk tumorcelledissosiasjon er et kritisk skritt i denne protokollen. Vevet må hakkes godt før inkubasjon i celledissosiasjonsoppløsning ved 37 °C under rotasjon, i minst 30 minutter, når vevet må tritureres mekanisk og forlengelsen av dissosiasjonen verifiseres. Avhengig av graden av vevssammenheft, kan inkubasjon utvides i ytterligere 15-30 minutter, etter behov for å fullføre dissosiasjon i enkeltceller. Inkubasjon i dissosiasjonsløsning i mer enn 1 time anbefales ikke på grunn av redusert celle levedyktighet. Selv om den optimale mengden startvev er 200-500 mg, har denne protokollen ført til vellykkede nevrosfærekulturer fra så lite som 50 mg tumorvev.
Serumfri NMGF er et selektivt medium, og en prosentandel av neoplastiske celler som består av hoveddelen av svulsten, samt vertsceller, vil ikke overleve, mens andre vil feste seg til vevskulturbehandlet kolbe etter plating. Det er kritisk at nevrosfærene som vil danne seg over 1-3 uker (Figur 1B-E) overføres til friske kolber, for å skille seg fra differensierte tumorceller og rusk.
GBM-celler enzymatisk dissosiert og aldri kultivert (trinn 1.10) kan kryopreserveres som en reservekilde for celler til kultur i alternative medier, i tilfelle nevrosfærens kultur mislykkes. Vi har lykkes med å skaffe nevrosfærekulturer fra slike frosne bestander, samt monolayerceller som vokser i 2% FBS / NMGF.
Konseptuelt er “kreft stamcelle” et pågående arbeid, og dette fremvoksende feltet vil dra nytte av ytterligere avklaring, siden de kliniske implikasjonene er betydelige, spesielt i genereringen av tumor heterogenitet, plastisitet og motstand mot terapi19,20. I tillegg til å være avgjørende for å generere pasientspesifikke GBM-dyremodeller, er nevrosfærens kulturer også verdifulle for in vitro-studier som endring i cellesignalering og genuttrykk som svar på vekstfaktorer, hypoksi og farmakologiske midler11,21. Vi har valgt å bruke tverrsnitt av formalin faste og paraffin innebygde nevrosfærer, bevare 3D-arkitekturen, for å studere proteinuttrykk og post-translasjonelle modifikasjoner ved immunhiistokjemi11, på grunn av overlegen subcellulær lokalisering i forhold til den mer vanlige metoden for merking og avbildning av hele sfæren.
Det har vist seg at ikke alle celler innen nevrosfærer avledet fra voksen pattedyrhjerne er stamceller22. På samme måte er nevrosfærene dyrket fra GBM svulster sannsynligvis ikke kloniske, på grunn av tilstedeværelsen av mer differensierte kreftforfedrederceller og selvaggregering, kjent for å forekomme ved høye celletettheter23, som regnes som en begrensning av denne metoden av noen. For å favorisere berikelse for langsiktige selvfornyende stamceller, i motsetning til bare forfedre som midlertidig kan vokse som nevrosfærer22, blir de primære nevrosfærene dissosiert for sekundær nevrosfæredannelse, og videre passerer i minst 10 passasjer, omtrent tilsvarende 2 måneder i kontinuerlig kultur, noe som er en indikasjon på en befolkning beriket i stamceller22. Vår erfaring er at GBM-nevrosfærekulturer som oppnår dette merket, kan fortsette å ekspandere som nevrosfærer på ubestemt tid. Tumor karakter betyr noe, siden vi har fått vellykkede kulturer fra GBMs og anaplastiske astrocytomas, WHO klasse IV og III, henholdsvis, men ikke fra lavere klasse gliomas.
Den mest utbredte metoden for å dyrke glioblastomceller, i tradisjonelt vekstmedium supplert med 10% FBS, fører til betydelig genomisk og fenotypisk divergens fra de opprinnelige svulstene 4. På den annen side er nevrosfærekulturer en stabil og langsiktig kilde til celler som presenterer kreft stamcelle fenotype4. Nevrosfæren metoden har blitt stadig mer populær for berikelse av CSC i langsiktige kulturer for ortotopiske mus xenograft modeller, til tross for ikke å lykkes for alle høyverdige astrocytomprøver, som representerer den viktigste svakheten ved denne metoden. Studier for å forstå hvordan molekylære egenskaper ved foreldresvulstene kan påvirke nevrosfærens dannelse er i gang. Utforskning av praktiske alternative metoder for å dyrke høyverdige gliomer, etterfulgt av omfattende validering, er gitt de bemerkelsesverdige fordelene ved å ha pasientspesifikke GBM-modeller, når vi går inn i en epoke med personlig medisin, drevet av tilgjengeligheten av “omics” -informasjon og økt antall potensielle målrettede terapier.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet har blitt finansiert av Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |