Automatiseret Adskillelse af<em> C. elegans</em> Variabel koloniseret af et bakterielt patogen

Summary

Den wormsorter letter genetiske skærme i Caenorhabditis elegans ved at sortere orme ifølge udtryk for fluorescerende journalister. Her beskriver vi en ny anvendelse: sortering efter kolonisering af en GFP-udtrykkende patogen, og vi beskæftiger det at undersøge dårligt forstået rolle patogen anerkendelse i at indlede immunrespons.

Abstract

Den wormsorter er et instrument, svarer til en FACS maskine, der anvendes i undersøgelser af Caenorhabditis elegans, typisk at sortere orme baseret på ekspression af en fluorescerende reporter. Her vil vi fremhæve en alternativ anvendelse af dette instrument, til sortering orme efter graden af ​​deres kolonisering af en GFP-udtrykkende patogen. Denne nye anvendelse tilladt os at tage forholdet mellem kolonisering af orm tarmen og induktion af immunreaktioner. Mens C. elegans immunreaktioner på forskellige patogener er blevet dokumenteret, er det stadig ukendt, hvad der igangsætter dem. De to vigtigste muligheder (som ikke udelukker hinanden) er indregning af patogen-associerede molekylære mønstre, og afsløring af skader forårsaget af infektion. At skelne mellem de to muligheder, skal eksponering for patogenet kan adskilles fra de skader, den forårsager. Den wormsorter aktiveret adskillelse af orme, der blev udstrakt-koloniseret af Gram-negativ patogen Pseudomonas aeruginosa, med skaden sandsynligvis forårsaget af patogen belastning, fra orme, der blev ligeledes udsat for, men ikke, eller marginalt, koloniseret. Disse forskellige populationer blev brugt til at vurdere forholdet mellem patogen belastning og induktion af transskriptionelle immunreaktioner. Resultaterne antyder, at de to er adskilt, støtter muligheden for patogen anerkendelse.

Introduction

Automatisk orm sortering er meget ligesom FACS, der opererer ved at måle et fluorescerende signal i en orm (som typisk udbydes af transgen ekspression af reporter-proteiner), da det passerer rettede i et rør, så omdirigering enten til en samling rør / brønd eller til en affaldsbeholder ifølge til gating parametre af forskeren ^1.. Den wormsorter kan fremme forskning på mange måder, et eksempel på at ansætte det som et analytisk værktøj er en undersøgelse, der fulgte spatiotemporale mønstre af promotor aktivitet for næsten 1.000 gener ^2.
Men den væsentligste anvendelse af wormsorter er genetiske skærme efter målgenekspression niveauer eller lokalisering af fluorescerende protein langs aksen af snekken ^3-5.

Her beskriver vi en ny ansøgning om wormsorter, i følge kolonisering af ormen med en fluorescens-mærkede patogen. Med dette som et værktøj, vi fokuserede på forholdet mellem Pathogen kolonisering / belastning og immunrespons, at få ny indsigt i de mekanismer, der er ansvarlige for iværksættelse af immunreaktioner i ormen.

I næsten alle organismer er undersøgt til dato, indledning af medfødte immunrespons til mikrobielle patogener afhænger anerkendelse af patogen-associerede molekylære mønstre (PAMPs), og / eller fare / skade-associeret molekylære mønstre (dæmper) ^6,7. De første er konserverede mikrobielle strukturer, der omfatter dele af den mikrobielle cellevæg, dets flagellum eller dens tolagede ^6, det andet omfatter både frigivet molekyler (fx ATP ^8), ændrede proteiner eller andre markører for ændrede cellulære processer ^9,10. Begge typer af signaler er anerkendt af proteiner, der er udpeget som mønstergenkendelse receptorer (PRRS), som ved specifik binding af et mønster molekyle aktiverer en kæde af begivenheder, der fører til et beskyttende respons. C. elegans har været yderst nyttig som en tractaligt model til at dissekere forskellige aspekter af vært-patogen interaktioner, men én ting, der er ikke godt forstået, er, hvordan immunreaktioner indledes i ormen. Ingen af ​​de putative receptorer, der er orthologe til mønstergenkendelse receptorer (PRRS) i andre organismer er blevet vist at binde PAMPs, og mange af de orthologer PRRS, som er afgørende for immunreaktioner i andre organismer viser en overraskende begrænset bidrag til orm patogene reaktioner og modstand. For eksempel er Drosophila Toll receptor, hvilket er vigtigt for at modstå Gram-positive patogener, repræsenteret i C. elegans ved en eneste homolog, tol-1, som bidrager til beskyttelse mod Gram negative patogener Salmonella Typhimurium ^11, men ikke fra andre testede Gram-negative eller positive patogener ^11,12. Disse observationer, kombineret med data indikerer, at immunreaktioner kunne induceres ved at forstyrre cellulært protein translation hsom førte nogle til at foreslå, at C. elegans primært registrerer dæmper ^9,13,14. Ikke desto mindre rapporter, der beskriver evne døde patogener til at fremkalde immunrespons tyder på, at PAMP binding kan have en vigtig rolle i patogen anerkendelse i C. elegans ^15,16. Tidligere arbejde med fokus på immunreaktioner i alderen synkroniseret genetisk identisk C. elegans befolkninger, viste stor individuel variation i intestinal kolonisering af den bakterielle Gram-negative patogener Pseudomonas aeruginosa.

Men transskriptionsprofilering undersøgelser behandlede disse trinløst koloniserede befolkninger som én enhed ^17,18. Drage fordel af denne variation, har vi udviklet en protokol fokusering en automatiseret wormsorter at adskille forskelligt koloniserede befolkninger Caenorhabditis elegans udsat for GFP-udtrykkende P. aeruginosa. Undersøgelse genekspression i forskelligt-koloniserede befolkninger Facilitated vurdering af forholdet mellem patogen belastning (og den tilhørende skader) og immunreaktioner og givet nye indsigter om patogen anerkendelse i C. elegans ^19.. Nedenfor beskrives protokollen, som kan anvendes til at sortere orme inficeret med nogen fluorescens-mærkede patogen.

Til potentielle brugere skal det bemærkes, at antallet af orme der kræves for at blive sorteret, afhænger af arten af ​​de efterfølgende analyser og protokoller i brug. For eksempel i tilfælde af microarray genekspression analyse> 1.000 orme vil blive forpligtet til at indhente nok RNA, hvis der anvendes standardprotokoller, men ~ 100 orme ville være tilstrækkeligt, hvis forstærkning er ansat, så hurtig indsamling af materiale og dermed minimere stress til orme.

Protocol

1.. Opnåelsen af ​​et synkroniseret kultur unge voksne dyr Grow orme på flere NGM plader podet med OP50-1 E. colibakterier (10x koncentreret fra en mættet kultur), indtil mange orme har nået den gravide stadie. Forkæl GRAVID dyr med æg-prep løsning til at opnå en synkroniseret kultur (æg). Plate æg på flere 60-mm NGM plader podet med 10x koncentreret OP50-1 ved en densitet på omkring 150-200 æg / plade. Pladerne inkuberes ved 25 ° C i 2 dage (indtil orm…

Representative Results

Når alder-matchede, genetisk identisk C. elegans udsættes for P. aeruginosa, iagttages en bred fordeling i niveauet af kolonisering (figur 1A). Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her effektiv separation af noncolonized fra koloniserede orme kan opnås (Figur 1B). I modsætning noncolonized orme, koloniserede orme vise tegn på skader, såsom træghed og reduceret afføring 19. Sidstnævnte kan være en grund til, at orme koloniseret af P. aer…

Discussion

Fremgangsmåden beskriver vi drager fordel af fluorescerende mærkning af enheder uden for orm, til at følge interaktionen mellem snekken og dens omgivelser. I tilfælde vi præsenterer, er separation baseret på mærkning af et patogen og blev ansat til at adskille orme med tung patogen belastning fra dem uden (eller lys) belastning. Efterfølgende genekspressionsanalyse fandt ingen forskel i immunresponser mellem de to grupper, hvilket tyder på, at de var uafhængige af patogen belastning. Det signal, som initierer …

Materials

M9 Buffer	Prepared in house	Recipe at wormbook.org
Rifampicin	Sigma	R3501
Egg prep solution	Prepared in house	50ml water ; 40ml bleach ; 10ml of 10N Sodium Hydroxide
NGM plates	Prepared in house	Recipe at wormbook.org
SKP plates	Prepared in house	Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%
Control test particles	Union Biometrica	310-5071-001