Geautomatiseerde Scheiding van<em> C. elegans</em> Variabel gekoloniseerd door een bacteriële pathogenen

Summary

De wormsorter vergemakkelijkt genetische screens in Caenorhabditis elegans door het sorteren wormen volgens expressie van fluorescerende verslaggevers. Hier beschrijven we een nieuw gebruik: sorteren volgens kolonisatie door een GFP-expressie ziekteverwekker, en we gebruiken het om de slecht begrepen rol van pathogeen herkenning bij het initiëren van immuunreacties te onderzoeken.

Abstract

De wormsorter is een instrument analoog aan een FACS machine die wordt gebruikt in studies van Caenorhabditis elegans, doorgaans naar wormen basis van expressie van een reporter fluorescent sorteren. Hier hebben we aandacht voor een alternatief gebruik van dit instrument, voor het sorteren wormen volgens hun mate van kolonisatie door een GFP-expressie ziekteverwekker. Dit nieuwe gebruik konden we de relatie tussen kolonisatie van de darm worm en inductie van immuunresponsen pakken. Terwijl C. elegans immuunrespons op verschillende pathogenen zijn gedocumenteerd, is nog onbekend wat hen initieert. De twee belangrijkste mogelijkheden (die elkaar niet uitsluiten) zijn erkenning van pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen, en detectie van schade veroorzaakt door een infectie. Om onderscheid te maken tussen de twee mogelijkheden, moet de blootstelling aan de ziekteverwekker worden gezien van de schade die ze toebrengen. De wormsorter ingeschakeld scheiding van wormen die werden uitgebreid-gekoloniseerd door de Gram-negatief pathogeen Pseudomonas aeruginosa, met de schade die wordt veroorzaakt door pathogenen, van wormen die op soortgelijke wijze zijn blootgesteld, maar niet of marginaal, gekoloniseerd. Deze verschillende populaties werden gebruikt om het verband tussen pathogenen en de inductie van transcriptionele immuunresponsen beoordelen. De resultaten suggereren dat de twee worden gescheiden, ondersteunen de mogelijkheid van pathogeen herkenning.

Introduction

Automatische worm sortering is net als FACS, die door het meten van een fluorescerend signaal in een worm (die normaal door transgene expressie van reporter eiwitten) bij het passeren rechtgetrokken in een buis, waardoor omleiding hetzij naar een verzamelcentrum buis / put of een afvalcontainer volgens aan het poorten van de onderzoeker ¹ set parameters. De wormsorter kan op verschillende manieren onderzoek te vergemakkelijken; een voorbeeld van het gebruik van het als een analytisch instrument is een studie die spatiotemporele promotor activiteit gevolgd voor bijna 1.000 genen ^2.
Echter, het belangrijkste gebruik van de wormsorter in genetische screens, na doelwitgen expressieniveaus of lokalisatie van fluorescerend eiwit langs de as van de worm ^3-5.

Hier beschrijven we een nieuwe applicatie voor de wormsorter, in het volgen van kolonisatie van de worm door een fluorescent gelabeld ziekteverwekker. Met dit als een instrument hebben we ons gericht op de relatie tussen Pathognl kolonisatie / lading en de immuunrespons, tot nieuwe inzichten in de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de start van de immuunreacties van de worm te krijgen.

In vrijwel alle tot nu toe onderzochte organismen, initiatie van de aangeboren immuunrespons op microbiële ziekteverwekkers is afhankelijk van de erkenning van pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), en / of gevaar /-schade geassocieerde moleculaire patronen (dempt) ^6,7. De eerste geconserveerd microbiële structuren die componenten van de microbiële celwand, het flagellum of de lipide bilaag ⁶ zijn, de tweede zowel model moleculen (bijv. ATP ^8), veranderde eiwitten of andere merkers van veranderde cellulaire processen ^9,10. Beide signalen worden herkend door eiwitten die als patroonherkenning receptoren (PRRS), die bij specifieke binding van een patroon molecuul activeert een keten van gebeurtenissen die leiden tot een beschermende respons. C. elegans is uiterst nuttig als tracta geweestble model om de verschillende aspecten van gastheer-pathogeen interacties te ontleden, maar een ding dat niet goed begrepen is hoe immuunreacties worden geïnitieerd in de worm. Geen van de vermeende receptoren die ortholoog patroonherkenning receptoren (PRRS) bij andere organismen is aangetoond PAMPs binden, en veel van de orthologen van PRRS die cruciaal voor immune responsen in andere organismen vertonen een verrassend beperkte bijdrage aan worm pathogeen reacties en weerstand. Zo is het Drosophila Toll-receptor, die essentieel zijn voor het weren grampositieve pathogenen, vertegenwoordigd C. elegans door een enkele homoloog, tol-1, die bijdraagt ​​aan bescherming tegen de Gram negatieve pathogeen Salmonella Typhimurium ^11, maar niet van andere geteste Gram-negatieve of positieve pathogenen ^11,12. Deze waarnemingen, gecombineerd met gegevens die aangeven immuunrespons kan worden geïnduceerd door het verstoren cellulaire eiwittranslatie hals sommigen ertoe gebracht om voor te stellen dat C. elegans detecteert voornamelijk DAMPs ^9,13,14. Toch rapporten beschrijven het vermogen van dode ziekteverwekkers immuunrespons op te wekken suggereren dat PAMP bindend kunnen worden hebben een belangrijke rol in pathogeen herkenning in C. elegans ^15,16. Vorige werk gericht op immuunreacties in de leeftijd gesynchroniseerde genetisch identieke C. elegans populaties aangetoond grote individuele variabiliteit in de darmflora door de bacteriële Gram-negatieve pathogeen Pseudomonas aeruginosa.

Echter, transcriptionele profiling studies behandeld deze variabel-gekoloniseerde bevolking als een entiteit ^17,18. Profiteren van deze variabiliteit, een protocol gericht een geautomatiseerde wormsorter differentieel gekoloniseerde bevolking van Caenorhabditis elegans blootgesteld aan GFP-expressie P. scheiden ontwikkelden we aeruginosa. Het onderzoeken van genexpressie in verschillend-gekoloniseerde bevolking facilitated beoordeling van de relatie tussen ziekteverwekker belasting (en de bijbehorende schade) en immune reacties en nieuwe inzichten over pathogeen erkenning in C. elegans ^19. Hieronder beschrijven we het protocol, die kunnen worden toegepast wormen geïnfecteerd met elk fluorescent gelabelde pathogeen sorteren.

Om potentiële gebruikers moet worden opgemerkt dat het aantal wormen moet worden uitgezocht afhankelijk van de aard van de volgende analyses en gebruikte protocollen. Bijvoorbeeld, in het geval van microarray genexpressie analyse> 1000 wormen zullen moeten voldoende RNA verkrijgen als standaard protocollen worden gebruikt, maar ~ 100 wormen volstaat als versterking wordt toegepast, waardoor een snelle verzameling van materiaal en dus spanning te minimaliseren de wormen.

Protocol

1. Het verkrijgen van een gesynchroniseerde Cultuur van jonge volwassen dieren Groeien wormen op verschillende NGM platen bezaaid met OP50-1 E. coli bacteriën (10x geconcentreerd uit een verzadigde cultuur) tot veel wormen hebben de zwangere stadium. Behandel zwangere dieren met een ei-prep oplossing voor een gesynchroniseerde cultuur (eieren) te verkrijgen. Plaat eieren op verschillende 60-mm NGM platen geënt met 10x geconcentreerde OP50-1 met een dichtheid van ongeveer 150-200…

Representative Results

Wanneer leeftijd afgestemd, genetisch identiek C. elegans worden blootgesteld aan P. aeruginosa, is wijd verspreid waargenomen niveaus van kolonisatie (figuur 1A). Met behulp van de hier beschreven efficiënte scheiding van noncolonized uit gekoloniseerde wormen worden bereikt (figuur 1B) protocol. In tegenstelling tot noncolonized wormen, gekoloniseerd wormen vertonen tekenen van schade, zoals traagheid en verminderde ontlasting 19. Dit laatste kan een rede…

Discussion

De methode die we beschrijven maakt gebruik van TL-etikettering van entiteiten buiten de worm, om de interacties tussen de worm en zijn omgeving te volgen. In het geval dat we presenteren, werd de scheiding op basis van etikettering van een ziekteverwekker en werd gebruikt om afzonderlijke wormen met zware pathogeen last van degenen die geen (of lichte) belasting. Daaropvolgende genexpressie analyse vond geen verschil in immuunrespons tussen de twee groepen suggereren dat zij onafhankelijk van pathogenen. Het signaal da…

Materials

M9 Buffer	Prepared in house	Recipe at wormbook.org
Rifampicin	Sigma	R3501
Egg prep solution	Prepared in house	50ml water ; 40ml bleach ; 10ml of 10N Sodium Hydroxide
NGM plates	Prepared in house	Recipe at wormbook.org
SKP plates	Prepared in house	Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%
Control test particles	Union Biometrica	310-5071-001