Automatiserad Separation av<em> C. elegans</em> Steglös koloniseras av en bakteriell patogen

Summary

Den wormsorter underlättar genetiska skärmar i Caenorhabditis elegans genom att sortera maskar enligt uttryck av fluorescerande reportrar. Här beskriver vi en ny användning: sortering efter kolonisering av en GFP-uttryckande patogen, och vi använder den för att undersöka dåligt förstådda roll patogen erkännande i att initiera immunsvar.

Abstract

Den wormsorter är ett instrument som är analogt med en FACS-maskin som används i studier av Caenorhabditis elegans, typiskt för att sortera maskar baserade på expression av en fluorescerande reporter. Här lyfter vi en alternativ användning av detta instrument, för att sortera maskar i förhållande till graden av kolonisering av en GFP-uttryckande patogen. Denna nya användning tillät oss att få förhållandet mellan koloniseringen av masken tarmen och induktion av immunsvar. Medan C. elegans immunsvar mot olika patogener har dokumenterats, det är fortfarande okänt vad som initierar dem. De två möjligheter (som inte utesluter varandra) är erkännandet av patogen-associerade molekylära mönster, och upptäckt av skador som orsakas av infektion. För att skilja mellan de två möjligheter, måste exponering för patogenen att skilja från de skador den orsakar. Den wormsorter aktiverat separation av maskar som extensivt koloniserades av Gram-negative patogen Pseudomonas aeruginosa, med skador som sannolikt orsakats av patogener last, från maskar som exponerats på liknande sätt, men inte, eller marginellt, koloniserade. Dessa skilda populationer användes för att bedöma förhållandet mellan patogen belastning och induktion av transkriptionsimmunsvar. Resultaten tyder på att två dissocieras, stödja möjligheten att patogenen erkännande.

Introduction

Automatisk mask sortering är ungefär som FACS, som verkar genom att mäta en fluorescerande signal i en mask (normalt från transgent uttryck av reporterproteiner) när den passerar rätade i ett rör, vilket gör omdirigering antingen till ett provrör / bra eller till en avfallsbehållare enligt till slussning parametrar som forskaren ^1. Den wormsorter kan underlätta forskning på många sätt, ett exempel på att använda det som ett analytiskt verktyg är en studie som följde Spatiotemporal mönster av promotoraktivitet för nästan 1.000 gener ^2.
Emellertid är den huvudsakliga användningen av wormsorter i genetiska skärmar, efter målgenuttryck nivåer eller lokalisering av fluorescerande protein längs axeln av snäck ^3-5.

Här beskriver vi en ny ansökan om wormsorter, i följande koloniseringen av masken med en fluorescensmärkta patogen. Med detta som ett verktyg som vi fokuserat på förhållandet mellan Pathogsv kolonisering / belastning och immunförsvaret, för att få nya insikter i de mekanismer som ansvarar för initiering av immunsvar i masken.

I praktiskt taget alla organismer som studerats hittills, initiering av medfödda immunsvar mot patogena mikroorganismer är beroende av erkännande av patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs), och / eller fara / skada-associerade molekylära mönster (dämpas) ^6,7. Den första är bevarade mikrobiella strukturer som inkluderar komponenter i den mikrobiella cellväggen, dess flagellum, eller dess membranet ^6, den andra omfattar både släppt molekyler (t.ex. ATP ^8), förändrade proteiner eller andra markörer för förändrade cellulära processer ^9,10. Båda typerna av signaler känns igen av proteiner som betecknas som mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS), som vid specifik bindning av en mönstermolekyl aktiverar en kedja av händelser som leder till ett skyddande svar. C. elegans har varit extremt användbar som en tractable modell att dissekera olika aspekter av värd-patogen interaktioner, men en sak som inte har förstått är hur immunsvar initieras i masken. Ingen av de förmodade receptorer som är ortologa till mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS) i andra organismer har visat sig binda PAMPs, och många av ortologer PRRS som är avgörande för immunsvar hos andra organismer visar en förvånansvärt begränsat bidrag till mask patogena svar och motstånd. Till exempel är Drosophila Toll-receptorn, som är nödvändig för att motstå grampositiva patogener, som representeras i C. elegans med en enda homolog, tol-1, vilket bidrar till skydd mot gramnegativa patogener Salmonella Typhimurium ^11, men inte från andra testade gramnegativa, eller positiva patogener ^11,12. Dessa observationer i kombination med data som indikerar att immunsvar kan induceras genom att störa cellulära proteinet översättnings hsom ledde en del som tyder på att C. elegans detekterar primärt dämpar ^9,13,14. Trots rapporter som beskriver förmåga döda patogener för att inducera immunsvar tyder på att PAMP bindning kan ha en viktig roll i patogen erkännande i C. elegans ^15,16. Tidigare arbete med inriktning på immunsvar i ålders synkroniseras genetiskt identiska C. elegans populationer, visade stor individuell variation i intestinal kolonisering av den bakteriella gramnegativa patogener Pseudomonas aeruginosa.

Men transkriptionsprofileringsstudier behandlade dessa variabelt-koloniserade befolkningsgrupper som en enhet ^17,18. Med utnyttjande av denna variation, utvecklade vi ett protokoll fokuserar en automatiserad wormsorter att separera differentiellt koloniserade populationer av Caenorhabditis elegans som utsätts för GFP-uttryck P. aeruginosa. Undersöka genuttryck i olika-koloniserade befolknings facilitated bedömning av förhållandet mellan patogen belastning (och tillhörande skador) och immunsvar och som nya insikter om patogen erkännande i C. elegans ^19. Nedan beskriver vi de protokoll, som skulle kunna tillämpas för att sortera maskar infekterade med någon fluorescerande patogen.

Till potentiella användare bör det noteras att antalet maskar som måste redas ut beror på typen av efterföljande analyser och protokoll som används. Till exempel, i fallet med mikroarray genuttrycksanalys,> 1000 maskar kommer att krävas för att erhålla tillräckligt med RNA, om standardprotokoll används, men ~ 100 maskar skulle räcka om förstärkning används, tillåter snabb insamling av material och på så sätt minimera stress för maskarna.

Protocol

1. Skaffa en synkroniserad Kultur för unga vuxna djur Odla maskar på flera NGM plattor ympats med OP50-1 E. coli-bakterier (10x koncentrerad från en mättad kultur) förrän många maskar har nått gravid scenen. Behandla gravida djur med ägg-prep-lösning för att erhålla en synkroniserad kultur (ägg). Tallrik ägg på flera 60-mm NGM plattor ympades med 10x koncentrerad OP50-1 vid en densitet av ungefär 150 till 200 ägg / platta. Inkubera plattorna vid 25 ° C …

Representative Results

När åldersmatchade, genetiskt identiska C. elegans utsätts för P. aeruginosa, är en bred spridning observerades i nivåer av kolonisering (Figur 1A). Med hjälp av det protokoll som beskrivs här för effektiv separation av noncolonized från koloniserade maskar kan uppnås (Figur 1B). Till skillnad noncolonized maskar, koloniserade maskar visar tecken på skada, som till exempel långsamma och minskad avföring 19. Det senare kan vara en anledning till…

Discussion

Den metod vi beskriva utnyttjar fluorescerande märkning av enheter utanför masken, för att följa växelverkan mellan masken och dess miljö. I det fall vi presenterar, var separation baserad på märkning av en patogen och var anställd för att separera maskar med tung patogen lasten från de utan (eller ljus) belastning. Efterföljande genuttrycksanalys fann ingen skillnad i immunsvar mellan de två grupperna tyder på att de var oberoende av patogen belastning. Signalen som initierar svaret visades någon annanst…

Materials

M9 Buffer	Prepared in house	Recipe at wormbook.org
Rifampicin	Sigma	R3501
Egg prep solution	Prepared in house	50ml water ; 40ml bleach ; 10ml of 10N Sodium Hydroxide
NGM plates	Prepared in house	Recipe at wormbook.org
SKP plates	Prepared in house	Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%
Control test particles	Union Biometrica	310-5071-001