JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

الكشف عن الجينوم والنصوص من الفيروسات الحمض النووي في الخلايا العصبية الأنسجة الثابتة التي كتبها نيون في الوضع الطبيعي التهجين جنبا إلى جنب مع المناعية

Published: January 23, 2014
doi:
10.3791/51091
, , ,
1Virus and Centromere Team, Centre de Génétique et Physiologie Moléculaire et Cellulaire,CNRS UMR 5534, 2Université de Lyon 1, 3Laboratoire d’excellence,LabEX DEVweCAN, 4Institut de Virologie Moléculaire et Structurale,CNRS UPR 3296, 5Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052,CNRS UMR 5286

Summary

أنشأنا فلوري التهجين الموضع البروتوكول في للكشف عن فيروس الحمض النووي الجينوم المستمرة داخل أقسام الأنسجة من النماذج الحيوانية. هذا البروتوكول يتيح دراسة عملية العدوى عن طريق codetection من الجينوم الفيروسي، والمنتجات RNA لها، والبروتينات الفيروسية أو الخلوية داخل الخلايا واحد.

Abstract

codetection خلية واحدة من الجين والمنتجات RNA والبروتينات الخلوية التنظيمية أمر بالغ الأهمية لدراسة الجينات تنظيم التعبير. هذا هو التحدي في مجال علم الفيروسات، وبصفة خاصة عن الفيروسات الحمض النووي المستمر-النووية التي تنطوي على تكرار نماذج حيوانية لدراستهم. نوع فيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1) يحدد عدوى مدى الحياة كامنة في الخلايا العصبية الطرفية. يقدم الفيروس كامنا كما الخزان، من الذي ينشط ويؤدي الى حلقة جديدة العقبولية. يبقى بيولوجيا الخلية من HSV-1 كمون غير مفهومة، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود طرق للكشف عن HSV-1 الجينوم في الموقع في النماذج الحيوانية. نحن تصف الحمض النووي الفلورسنت الموقع التهجين (FISH) في نهج كشف بكفاءة-نسخة منخفضة الجينوم الفيروسي داخل أقسام الأنسجة العصبية من النماذج الحيوانية المصابة. وتعتمد الطريقة على القائم الحرارة مستضد إماطة اللثام، وتحقيقات الحمض النووي المسمى مباشرة الصنع، أو تحقيقات متاحة تجاريا. وضعنا الفول الثلاثينهج نينغ، والجمع بين الحمض النووي RNA-FISH مع FISH والمناعي، وذلك باستخدام البيروكسيديز مقرها إشارة التضخيم لاستيعاب كل متطلبات تلطيخ. وتحسن كبير هو القدرة على الحصول، في غضون 10 ميكرومتر أقسام الأنسجة، وإشارات منخفضة الخلفية التي يمكن تصويرها بدقة عالية بواسطة المجهر متحد البؤر واسعة المجال epifluorescence التقليدية. بالإضافة إلى ذلك، عملت تلطيخ ثلاثية مع مجموعة واسعة من الأجسام المضادة الموجهة ضد البروتينات الخلوية والفيروسية. بروتوكول كاملة يأخذ 2.5 أيام لاستيعاب الأجسام المضادة والاختراق التحقيق داخل الأنسجة.

Introduction

نوع فيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1) هو فيروس موجه للعصب الإنسان الثابتة، وإقامة العدوى الكامنة على المدى الطويل في الخلايا العصبية في العقد الثلاثي التوائم (TG) في الجهاز العصبي المحيطي، والتي كانت تعيد تجديد دوري لتكرار وانتشار. الجينوم HSV-1 هو 150 كيلو بايت dsDNA وإضفاء الطابع المحلي في نواة الخلايا العصبية المضيفة حيث لا يزال البلازميدات chromatinized multicopy كما، والتي لا الاندماج في الجينوم الخلية المضيفة 1،2. خلال الكمون، وقمعها بشدة برنامج جيني HSV-1 دورة تنسخي، ويقتصر التعبير الجيني للنسخة المرتبطة الكمون (LAT) موضع، من إنشاء الكمون لبدء تنشيط 3. LAT تنتج 8.5 كيلو بايت طويلة غير المكودة RNA معالجتها في كبرى 2 كيلو بايت الوهق مستقرة، والعديد من ميرنا 4-7. وهكذا يتميز HSV-1 كمون من خلال وجود الحمض النووي الفيروسي الجيني، LAT الحمض النووي الريبي، وعدم وجود كشف البروتينات دورة تنسخي.

ontent "> النماذج الحيوانية، في الغالب الماوس والأرنب، هي نماذج تجريبية تلخص العديد من الميزات من الكمون في الإنسان. واحدة من المصالح الرئيسية لتلك النماذج هو أنها تسمح بدراسة الجوانب الفسيولوجية للHSV-1 كمون في المضيفين مناعيا. على مدى العقود الماضية ، العديد من الأدوات التجريبية، مثل الفيروسات والفئران المعدلة وراثيا، وقد وضعت لدراسة علم وظائف الأعضاء، وعلم الوراثة، وعلم الأحياء الخلوية من HSV-1 كمون، من الأنسجة الحيوانية. وحتى الآن، تم الكشف عن الحمض النووي الجيني الفيروسي وكميا بواسطة لطخة الجنوبية و QPCR من فصلها TGS. ومع ذلك، لا يوجد حاليا أي وسيلة متاحة للكشف عن HSV-1 الجينوم بواسطة التهجين في الموقع على أقسام الأنسجة 8، وبالتالي يتم تقييم الكمون بشكل روتيني على المقاطع النسيجية من خلال الكشف عن الحمض النووي الريبي RNA LAT بواسطة التهجين في الموقع بدلا من الفيروسية كشف الجينوم. لأنه قد كان من المستحيل أن تميز الخلايا المصابة على أساس وجود الجينوم الفيروسي، ثيوقد ق الحد التقنية والعيب الرئيسي لتحليل جوانب كثيرة من التفاعلات المضيفة للفيروسات، مثل العلاقة بين الجينوم الفيروسي والخلوية والفيروسية التعبير الجيني أو بوساطة الخلية المضيفة استجابة مناعية 9،10.

الأهم من ذلك، عدم التجانس الخلية الى خلية من العدوى الكامنة لا تزال غير مستكشفة نسبيا، ولقد ثبت أن تكون سمة رئيسية من الكمون في الفئران في الخلايا العصبية والحسية العقدة الإنسان زرعها في الفئران SCID 11-17. عادة، فقد تبين من خلال QPCR أن الجينوم عدد النسخ HSV-1 في الخلية يختلف من 5 إلى عدة مئات. على الرغم من أن LAT يبدو كمنظم رئيسي من الكمون وتنشيط، أشارت البيانات QPCR على الخلايا العصبية معزولة في الموقع وPCR أنه ليس هناك سوى مجموعة فرعية من الخلايا العصبية المصابة خفية، منخفضة تصل إلى 30٪، ويعرب عن موضع LAT 11،12،18-21. كيف الخلية المضيفة والبيئة الخلوية داخل الأنسجة تأثير على إنشاء الكمون الفيروسات ويبقى التعبير الجيني الفيروسي غير واضحة. نحن هنا وصف الفلورسنت قوة التهجين الموضع (FISH) طريقة للكشف الفعال للنسخ منخفضة HSV-1 الحمض النووي الجيني داخل أقسام الأنسجة العصبية في الحيوانات. وقد تم تصميم هذه الطريقة واستخدامها من قبلنا للوصول إلى عالية الدقة التصوير المجهري ما هو ضروري لدراسة تفاعل الجينوم الفيروسي مع الخلية المضيفة المكونات داخل النووية 22. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف طريقة تلوين متعددة للكشف في وقت واحد من الحمض النووي الفيروسي RNA والبروتينات مع، التي هي أداة فريدة لوصف التفاعلات الفيروسات المضيف التي تنظم التعبير الجيني الفيروسي. ويمكن أيضا أن تطبق طريقة لمجموعة واسعة من التحليلات التي تتطلب الكشف عن HSV-1 الجينوم الكامنة، مثل قياس الخلايا العصبية المصابة في عدد كبير من الأقسام. والخطوة الرئيسية هي تطبيق المستضد العلاج استرجاع لجعل الحمض النووي الفيروسي للوصول إلى التهجين. وبالتالي، قد يكون هذا البروتوكول أيضا فعالة لكشفمن الفيروسات dsDNA وغيرها، والتي هي حاليا لا يمكن كشفها بواسطة النهج الحمض النووي FISH التقليدية داخل الأنسجة الحيوانية.

Protocol

وقد استخدم هذا الأسلوب في دراسة نشرت سابقا 22. لخلفية عامة ووصف التلاعب التقليدية على ISH، وإذا FISH، نقترح الأدبيات المتوفرة التالية 23. 1. عدوى الحيوان جميع الإجراءات التي تنطوي على حي?…

Representative Results

بعد عدة شهور من التجارب واسعة النطاق، اكتشفنا أن فضح الكيميائية القائمة على الحرارة الكامنة جعلت HSV-1 الجينوم المتاحة لفلوري التهجين في الموقع. خلال هذه العملية، حاولنا مختلف الإجراءات إماطة اللثام، والعلاجات فقط على أساس الحرارة (أي تسخين أقسام تصل إلى در?…

Discussion

بروتوكول الموصوفة هنا يسمح للكشف عن HSV-1 الجينوم الكامنة داخل الخلايا العصبية من الماوس أقسام الأنسجة العصبية. وقد فهمنا من مسارات تنظيم التعبير الجيني الفيروسي محدودة بسبب عدم وجود طريقة للكشف عن HSV-1 الحمض النووي الجيني في الموقع الطبيعي داخل الأنسجة العصبية. و…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر N. ساوتيل (الأطفال في سينسيناتي المركز الطبي في مستشفى سينسيناتي، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية)، S. افستاتيو (جامعة كامبريدج، المملكة المتحدة) وجيمس هيل (مركز العلوم الصحية LSU، نيو أورلينز، الولايات المتحدة الأمريكية) لتقديم عينات من HSV-1 الفئران والأرانب المصابة، على التوالي، وللمواد؛ H. ماسوموتو (معهد بحوث Kazusa الحمض النووي، شيبا، اليابان) وS. Khochbin (معهد ألبرت Bonniot، غرونوبل، فرنسا) لإجراء مناقشات مفيدة.

وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المركز الوطني للبحوث العلميه (CNRS) (برنامج ATIP، إلى PL، http://www.cnrs.fr)، والوكالة الفرنسية القومي للبحوث (وكالة الاستخبارات الوطنية) (ANR-05-MIIM- 008-01، CENTROLAT، http://www.agencenationale-recherche.fr )، ومؤسسة FINOVI ( http://www.finovi.org/:fr:start )، وLabEX DEVweCAN (ANR-10-LABX-61 ) من جامعة دي ليون، في إطار برنامج "Investissemenنهاية الخبر كوت أفينير "(ANR-11-0007-آيدكس) التي تديرها وكالة الاستخبارات الوطنية ( http://www.agence-nationale-recherche.fr )، أنا لا تصب جمعية بحوث السرطان مناهضة جنيه (ARC-ARC-7979 و 4910، http://www.arc-cancer.net )، الدوري الفرنسي الوطني كونتر جنيه السرطان (هروب، http://www.ligue-cancer.net )، والإنكا (برنامج EPIPRO، http://www.e -cancer.fr ). FC وPL هم باحثون CNRS.

Materials

Balb/c mice Janvier, France 6 week-old females
HSV-1 strains SC16 strain (wild type) See Labetoule, M. et al. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 217–225, for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.
Ketamine hydrochloride Sigma K2753 Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochloride Sigma X1251
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127 Suspend 4g of PFA in 90mL of water. Add 50µL of 1N NaOH, and heat at 60°C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30min. Add 10mL of 10X PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5mL tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.
Physiological Saline Sigma 07982-100TAB-F
1X PBS, pH 7.4 (sterile) Life Technologies 10010-015
Sucrose Sigma 84100 Prepare a 20% sucrose solution in 1X PBS.
Cryosectionning embedding medium – Tissue-Tek OCT Compound – SAKURA 4583
Large vector DNA purification kit Qiagen 12462 To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20°C
Nick translation kit Roche Applied Sciences 10 976 776 001
Cy3-dCTP GE Healthcare PA53021 Protect from light
0.5M EDTA Sigma E6758
G50 Mini spin column GE Healthcare 27-5330-01
Salmon sperm DNA 10mg/mL Invitrogen / Life Technologies 15632-011
Ethanol molecular biology grade Sigma 87047 Prepare a 70% solution
Salmon sperm DNA Invitrogen / Life Technologies 15632-011
Formamid Molecular biology grade Sigma F9037 Caution. Manipulate under fume hood.
HSV-1 biotinylated commercial probe Enzo Life Sciences ENZ-40838
ImmEdge hydrophobic pen Vector Laboratories H-4000
20X Saline Sodium Citrate (SSC) Sigma S6639 Prepare a 2X SSC solution in ddH20.
Triton X-100 Sigma T8787 Prepare a 10% stock solution in water and store at +4°C. Prepare the 0.5% solution in 1X PBS right before use.
10mM sodium citrate pH 6.0 Sigma S1804 Prepare a 100mM stock solution (10X). Weigh 10,5g of citric acid (MW 210.14. Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400mL water. Adjust pH at 6.0 with 1N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500mL with distilled water. Dilute 10 times in distilled water before use.
Acetic Acid Sigma 320099
Methanol, molecular biology grade Sigma 322415
Dextran sulfate – MW 500 000 Euromedex EU0606-A
Denhardt's solution (100X) Euromedex 1020-A
Rubber Cement "FixoGum" Marabut 290110000
DNA purification kit – Qiaquick PCR purification kit – Qiagen 28104
T7 in vitro transcription kit Ambion / Life Technologies AM1314
Biotin-16-UTP Roche Applied Sciences 11388908910
RNA purification mini-column Qiagen 73404
Ribonucleoside Vanadyl Complex New England Biolabs S1402S
H2O2 Sigma H3410 Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light.
Yeast tRNA Invitrogen 15401011 prepare a 10mg/mL solution in RNAse free water
Normal Goat Serum Invitrogen PCN5000
Primary antibodies Any supplier The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secondary fluorescent antibodies Invitrogen / Life Technologies The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are AlexaFluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with AlexaFluor 488 (reference A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 350 (blue fluorescence) Invitrogen / Life Technologies #T20937 TSA kits are also available from Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 488 (green fluorescence) Invitrogen / Life Technologies #T20932
Hoechst 33342 Invitrogen / Life Technologies H3570 Prepare a 0.5µg/mL solution in 1X PBS immediatly before use. Discard the remaining solution.
22x50mm coverslip. n°1.5 glass. Electron Microscopy Sciences 72204-04
Mounting medium with anti-fading agent – Vectashield – Vector Laboratories H-1000 Another conventional product is Fluoromount G from electron microscopy Science
Superfrost glass slides FisherScientific 12-550-15
EQUIPMENT
Equipment / material Company Reference Note
Needle for infection Glass micropipette hot drawn. Home made.
Dissection equipement Moria, France Microsurgical scissors and forceps
Peristaltic pump Cole Palmer Instruments Easyload Masterflex
Micro-syringe pump device (Nano Pump) kdScientific KDS310
Cryostat Leica France CM 1510-1
-80 °C freezer Sanyo Ultra Low -80°C
Domestic microwave oven
Dry block heater Eppendorf 022670204
Incubator Slide moat Boekel Scientific 240000
Coplin Jar Dominique Dutscher 68512
Staining glass container Dominique Dutscher 68506
Fluorescent microscope Zeiss The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective x40 LD NeoFluor N.A 0.6, and x100 PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43 and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knipe, D. M., Cliffe, A. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nat. Rev. Microbiol. 6 (3), 211-221 (2008).
  2. Bloom, D. C., Giordani, N. V., Kwiatkowski, D. L. Epigenetic regulation of latent HSV-1 gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 3-4 (2010).
  3. Stevens, J. G., Wagner, E. K., Devi-Rao, G. B., Cook, M. L., Feldman, L. T. RNA complementary to a herpesvirus alpha gene mRNA is prominent in latently infected neurons. Science. 235 (4792), 1056-1059 (1987).
  4. Zwaagstra, J., Ghiasi, H., Nesburn, A. B., Wechsler, S. L. In vitro promoter activity associated with the latency-associated transcript gene of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 70, 2163-2169 (1989).
  5. Farrell, M. J., Dobson, A. T., Feldman, L. T. Herpes simplex virus latency-associated transcript is a stable intron. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (3), 790-794 (1991).
  6. Umbach, J. L., Kramer, M. F., Jurak, I., Karnowski, H. W., Coen, D. M., Cullen, B. R. MicroRNAs expressed by herpes simplex virus 1 during latent infection regulate viral mRNAs. Nature. 454 (7205), 780-783 (2008).
  7. Jurak, I., Kramer, M. F., et al. Numerous conserved and divergent microRNAs expressed by herpes simplex viruses 1 and 2. J. Virol. 84 (9), 4659-4672 (2010).
  8. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10 (3), 419-443 (1997).
  9. Held, K., Junker, A., et al. Expression of herpes simplex virus 1-encoded microRNAs in human trigeminal ganglia and their relation to local T-cell infiltrates. J. Virol. 85 (19), 9680-9685 (2011).
  10. Held, K., Eiglmeier, I., et al. Clonal expansions of CD8⁺ T cells in latently HSV-1-infected human trigeminal ganglia. J. Neurovirol. 18 (1), 62-68 (2012).
  11. Sawtell, N. M. Comprehensive quantification of herpes simplex virus latency at the single-cell level. J. Virol. 71 (7), 5423-5431 (1997).
  12. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72 (7), 5343-5350 (1998).
  13. Bertke, A. S., Swanson, S. M., Chen, J., Imai, Y., Kinchington, P. R., Margolis, T. P. A5-positive primary sensory neurons are nonpermissive for productive infection with herpes simplex virus 1 in vitro. J. Virol. 85 (13), 6669-6677 (2011).
  14. Bertke, A. S., Ma, A., Margolis, M. S., Margolis, T. P. Different mechanisms regulate productive herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 infections in adult trigeminal neurons. J. Virol. 87 (11), 6512-6516 (2013).
  15. Kobayashi, M., Kim, J. Y., et al. A primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  16. Kim, J. Y., Mandarino, A., Chao, M. V., Mohr, I., Wilson, A. C. Transient reversal of episome silencing precedes VP16-dependent transcription during reactivation of latent HSV-1 in neurons. PLoS Pathog. 8 (2), (2012).
  17. Zerboni, L., Che, X., Reichelt, M., Qiao, Y., Gu, H., Arvin, A. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J. Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
  18. Mehta, A., Maggioncalda, J., et al. In situ DNA PCR and RNA hybridization detection of herpes simplex virus sequences in trigeminal ganglia of latently infected mice. Virology. 206 (1), 633-640 (1995).
  19. Chen, X. -. P., Mata, M., Kelley, M., Glorioso, J. C., Fink, D. J. The relationship of herpes simplex virus latency associated transcript expression to genome copy number: a quantitative study using laser capture microdissection. J. Neurovirol. 8 (3), 204-210 (2002).
  20. Proenca, J. T., Coleman, H. M., Connor, V., Winton, D. J., Efstathiou, S. A historical analysis of herpes simplex virus promoter activation in vivo reveals distinct populations of latently infected neurones. J. Gen. Virol. 89, 2965-2974 (2008).
  21. Nicoll, M. P., Proença, J. T., Connor, V., Efstathiou, S. Influence of herpes simplex virus 1 latency-associated transcripts on the establishment and maintenance of latency in the ROSA26R reporter mouse model. J. Virol. 86 (16), 8848-8858 (2012).
  22. Catez, F., Picard, C., et al. HSV-1 Genome Subnuclear Positioning and Associations with Host-Cell PML-NBs and Centromeres Regulate LAT Locus Transcription during Latency in Neurons. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
  23. Solovei, I., Grasser, F., Lanctôt, C. FISH on Histological Sections. CSH Protoc. , (2007).
  24. Labetoulle, M., Kucera, P., et al. Neuronal propagation of HSV1 from the oral mucosa to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (9), 2600-2606 (2000).
  25. Labetoulle, M., Maillet, S., Efstathiou, S., Dezelee, S., Frau, E., Lafay, F. HSV1 latency sites after inoculation in the lip: assessment of their localization and connections to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (1), 217-225 (2003).
  26. Maillet, S., Naas, T., et al. Herpes simplex virus type 1 latently infected neurons differentially express latency-associated and ICP0 transcripts. J. Virol. 80 (18), 9310-9321 (2006).
  27. Tanaka, M., Kagawa, H., Yamanashi, Y., Sata, T., Kawaguchi, Y. Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo. J. Virol. 77 (2), 1382-1391 (2003).
  28. Gierasch, W. W., Zimmerman, D. L., Ward, S. L., Vanheyningen, T. K., Romine, J. D., Leib, D. A. Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-1 strains 17 and KOS. J. Virol. Methods. 135 (2), 197-206 (2006).
  29. Nagel, C. -. H., Döhner, K., et al. Nuclear egress and envelopment of herpes simplex virus capsids analyzed with dual-color fluorescence HSV1(17). J. Virol. 82 (6), 3109-3124 (2008).
  30. Arthur, J., Efstathiou, S., Simmons, A. Intranuclear foci containing low abundance herpes simplex virus latency-associated transcripts visualized by non-isotopic in situ hybridization. J. Gen. Virol. 74, 1363-1370 (1993).
  31. Pileri, S. A., Roncador, G., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J. Pathol. 183, 116-123 (1997).
  32. Saito, N., Konishi, K., Takeda, H., Kato, M., Sugiyama, T., Asaka, M. Antigen retrieval trial for post-embedding immunoelectron microscopy by heating with several unmasking solutions. J. Histochem. Cytochem. 51 (8), 989-994 (2003).
  33. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J. Cell Biol. 134 (4), 815-826 (1996).
  34. Sourvinos, G., Everett, R. D. Visualization of parental HSV-1 genomes and replication compartments in association with ND10 in live infected cells. EMBO J. 21 (18), 4989-4997 (2002).
  35. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J. Virol. 81 (20), 10991-11004 (2007).
  36. Margolis, T. P., Imai, Y., Yang, L., Vallas, V., Krause, P. R. Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) establishes latent infection in a different population of ganglionic neurons than HSV-1: role of latency-associated transcripts. J. Virol. 81 (4), 1872-1878 (2007).
  37. Imai, Y., Apakupakul, K., Krause, P. R., Halford, W. P., Margolis, T. P. Investigation of the mechanism by which herpes simplex virus type 1 LAT sequences modulate preferential establishment of latent infection in mouse trigeminal ganglia. J. Virol. 83 (16), 7873-7882 (2009).
  38. Shi, S. -. R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 13-32 (2011).
  39. Lu, X., Triezenberg, S. J. Chromatin assembly on herpes simplex virus genomes during lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 217-222 (2010).
  40. Placek, B. J., Berger, S. L. Chromatin dynamics during herpes simplex virus-1 lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 223-227 (2010).
  41. Eshleman, E., Shahzad, A., Cohrs, R. J. Varicella zoster virus latency. Future Virol. 6 (3), 341-355 (2011).
  42. Paulus, C., Nitzsche, A., Nevels, M. Chromatinisation of herpesvirus genomes. Rev. Med. Virol. 20 (1), 34-50 (2010).
  43. Nitzsche, A., Paulus, C., Nevels, M. Temporal dynamics of cytomegalovirus chromatin assembly in productively infected human cells. J. Virol. 82 (22), 11167-11180 (2008).
  44. Zhou, J., Chau, C. M., et al. Cell cycle regulation of chromatin at an origin of DNA replication. EMBO J. 24 (7), 1406-1417 (2005).
  45. Day, L., Chau, C. M., Nebozhyn, M., Rennekamp, A. J., Showe, M., Lieberman, P. M. Chromatin profiling of Epstein-Barr virus latency control region. J. Virol. 81 (12), 6389-6401 (2007).
  46. Arvey, A., Tempera, I., Lieberman, P. M. Interpreting the Epstein-Barr Virus (EBV) Epigenome Using High-Throughput Data. Viruses. 5 (4), 1042-4254 (2013).
  47. Lu, F., Day, L., Gao, S. -. J., Lieberman, P. M. Acetylation of the latency-associated nuclear antigen regulates repression of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus lytic transcription. J. Virol. 80 (11), 5273-5282 (2006).
  48. Günther, T., Grundhoff, A. The epigenetic landscape of latent Kaposi sarcoma-associated herpesvirus genomes. PLoS Pathog. 6 (6), (2010).
  49. Toth, Z., Maglinte, D. T., et al. Epigenetic analysis of KSHV latent and lytic genomes. PLoS Pathog. 6 (7), (2010).

Tags

DNA-FISHRNA-FISHImmunofluorescenceHSV-1LatencyGene Expression RegulationSingle Cell Analysis
check_url/kr/51091?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Catez, F., Rousseau, A., Labetoulle, M., Lomonte, P. Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining. J. Vis. Exp. (83), e51091, doi:10.3791/51091 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image