Sensing af Barrier vævssprængning med en organisk Elektrokemisk Transistor
Summary
The Organic Elektrokemisk Transistor er integreret med levende celler og anvendes til at overvåge ion flux på tværs af mave epitelbarriere. I denne undersøgelse blev en stigning i ion-flux, relateret til forstyrrelse af tight junctions induceret ved tilstedeværelsen af calcium chelator EGTA (ethylenglycol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetra-eddikesyre syre), måles.
Abstract
Mave-tarmkanalen er et eksempel på barriere væv, der tilvejebringer en fysisk barriere mod indtrængen af patogener og toksiner, samtidig med at passage af nødvendige ioner og molekyler. Brud på denne barriere kan være forårsaget af en reduktion af ekstracellulært calcium koncentration. Denne reduktion i calciumkoncentration forårsager en konformationsændring i proteiner involveret i forseglingen af barrieren, hvilket fører til en forøgelse af paracellulær flux. At efterligne denne effekt calcium chelator ethylenglycol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraeddikesyre (EGTA), der anvendes på et monolag af celler er kendt for at være repræsentativ for mave-tarmkanalen. Der findes allerede forskellige metoder til at detektere afbrydelse af barrieren væv, såsom immunfluorescens og permeabilitet assays. Men disse metoder er tidskrævende og kostbar og ikke egnet til dynamiske eller high-throughput målinger. Elektroniske metoder til måling barriere vævintegritet findes også for måling af transepithelial resistens (TER), men disse er ofte dyre og komplekse. Udvikling af hurtige, billige, og følsomme metoder er et presserende behov som integriteten af barriere væv er en vigtig parameter i lægemiddelforskning og patogen / toksin diagnostik. Den organiske elektrokemisk transistor (OECT) integreret med barriere væv dannende celler er blevet vist som en ny enhed i stand til dynamisk at overvåge barriere væv integritet. Indretningen er i stand til at måle små variationer i ionisk flux med en hidtil uset tidsmæssige opløsning og følsomhed i realtid, som en indikator for barriere væv integritet. Denne nye metode er baseret på en enkelt enhed, der kan være forenelig med high throughput screening applikationer og fremstillet med lave omkostninger.
Introduction
Den mavetarmepitel er et eksempel på barriere væv, som styrer passagen af molekyler mellem forskellige rum i kroppen. Epitelet består af aflange søjleceller sammenføjet af komplekser af proteiner, der giver en fysisk barriere 1 mod patogener og toksiner, samtidig tillader passage af vand og næringsstoffer, der kræves for at opretholde kroppen. Denne selektivitet skyldes polarisering af epitelceller, som skaber to forskellige membran domæner: den apikale side af cellerne udsat for hulrummet og den basale side af cellerne forankret på det underliggende væv 2,3. Tight junctions (TJ), er komplekser af proteiner til stede i den apikale del af epitelceller og er en del af et større kompleks kendt som den apikale junction 4. Ionstrøm over barrieren væv kan enten gå via transcellulær (gennem cellen) eller via en paracellulær (mellem to tilstødende celler) vej. Summen aftransport gennem begge veje er kendt som transepitelial modstand. Den apikale vejkryds er ansvarlig for reguleringen af ioner og molekyler, der passerer hen over barrieren 5,6 via en specifik åbning og lukning funktion. En dysfunktion eller afbrydelse af disse protein komplekser er ofte relateret til sygdom 7-11. Desuden er mange enteriske patogener / toksiner er kendt for specifikt at målrette denne komplekset, og derved ind i kroppen og fører til diarré, sandsynligvis som følge af massiv dysregulering ion / vandstrømmen over barrieren 12-14. Barrier væv kan også modificeres ved at ændre den ekstracellulære mikromiljø. Cadherin er en kritisk protein for celle-celle-adhæsion og er involveret i dannelsen af den apikale krydset. Calcium er påkrævet for den korrekte strukturelle konformation af cadherin, og et fald i ekstracellulær calcium har vist sig at resultere i destruktion af celle-celle krydset og en efterfølgende åbning afparacellulær vej mellem cellerne 15. I denne undersøgelse, EGTA (ethylenglycol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraeddikesyre), en særlig calcium chelator, blev anvendt til at fremkalde et brud på barriere væv, som det har vist sig at have en hurtig og drastisk virkning på paracellulær ion flow 16,17. Dette calcium chelator brugt på et sammenflydende og differentierede monolag af Caco-2-celle linie. Dyrket i cellekultur skær, er denne cellelinie kendt for at udvikle karakteristika mavetarmkanalen og er almindeligt anvendt af den farmaceutiske industri til at teste absorptionen af lægemidler 18,19.
Metoder til at overvåge barriere væv integritet er rigeligt. Disse metoder er ofte optisk, bygger på immunfluorescensfarvning af bestemte proteiner er kendt for at være på den apikale junction 20, eller stole på kvantificering af et fluorescerende sporstof molekyle, der normalt er uigennemtrængeligt for barrieren væv21,22. Men label-free metoder (dvs. uden en fluorofor / kromofor) er at foretrække, da anvendelsen af et mærke kan pådrage artefakter og ofte øger omkostninger og assaytid. Elektrisk, etiket-fri overvågning af barriere væv har for nylig vist sig som en dynamisk overvågning metode 23. For eksempel nylige teknologiske fremskridt i elektrisk impedans spektroskopi har tilladt udviklingen af et kommercielt tilgængelige apparater til skanning 24,25, der kan måle transepithelial resistens (TER), en måling af ion-ledningsevne over cellelaget.
Organisk elektronik har skabt en unik mulighed for at kommunikere verden af elektronik og biologi 26,27 28,29 ved hjælp af ledende polymerer, der kan gennemføre både elektroniske og ioniske bærere. En ny teknik til at opdage brud på barriere væv ved hjælp af OECT 30-32 nylig blev indført. Denne enhed blev valideret mod eksisterende teknikker osed at vurdere barriere vævsintegritet, herunder immunofluorescens assays permeabilitet ved hjælp af Lucifer gul og impedansspektroskopi ved hjælp af Cellzscope. I tilfælde af alle toksiske testede forbindelser blev OECT fundet til at fungere med samme eller bedre følsomhed og med forøget tidsmæssig opløsning, sammenlignet med de ovennævnte teknikker. I denne anordning PEDOT: PSS, en ledende polymer, som har vist sig at være stabile og biokompatible 33,34, anvendes som det aktive materiale i transistoren kanal. Den OECT består af drain og source-elektroder på hver side af en ledende polymer kanal. Denne placeres derefter i kontakt med en elektrolyt, der udgør en integrerende del af indretningen. En port elektrode nedsænkes i elektrolytten (Figur 1), og når en positiv gate spænding anvendes ved gaten, er kationer fra elektrolytten tvunget ind i kanalen, og dermed dedoping den ledende polymer og resulterer i en ændring i-drain kilde strøm. Den device er således yderst følsomme over for minut ændringer i ioniske flux skyldes amplifikation af transistoren. En celle lag dyrkes på en cellekultur insert blev placeret mellem gateelektroden og ledende polymer kanal. Tilstedeværelsen af et intakt cellelag fungerer som barriere for kationer ind i den ledende polymer, således, i nærvær af et intakt monolag dræn strømmen aftager (Figur 2: overgang fra en region til b). I nærvær af en toksisk forbindelse, vil barrieren væv gradvis miste sin integritet, lade kationer ind i polymerfilmen og øge drainstrømmen (Figur 2: region c). Med denne teknik, er brud på barrieren væv ses ved modulering af drainstrøm svarende til modulationen af strømningen igennem monolaget. Denne enhed er i stand til at måle små variationer i ionisk flusmiddel med en hidtil uset tidsmæssig opløsning og følsomhed i realtid. Denne teknologi will være af interesse på området for toksikologi for narkotika testning, sygdomsdiagnostik eller grundforskning som barriere modellen kan let tilpasses. Denne metode vil også bidrage til at mindske dyreforsøg, da det giver mulighed for validering af in vitro modeller til at erstatte in vivo-testning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne teknik giver en ny metode til at integrere en organisk elektrokemisk transistor med levende celler til at måle barriere væv integritet. De vigtigste fordele ved denne teknik er den hurtighed og følsomhed, men også de lave omkostninger af indretningen til dynamisk overvågning af barriere væv.
Da denne metode bruger levende celler, et kritisk punkt er at være sikker på at bruge en monolag, som repræsenterer et intakt barriere lag. Bør defineres parametre barrieren under karakte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne af dette papir ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| CLEVIOS PH 1000 | HERAUS CLEVIOS | ||
| AZ9260 resin | CIPEC SPECIALITIES | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique dutscher | 51705 | |
| 24-well cell culture plate BD Falcon | Dominique dutscher | 51705 | |
| STERICUP-GP PES 0.22 μM | Dominique dutscher | 51246 | |
| ADVANCED DMEM Marque GIBCO | Fisher scientific | E3434T | |
| FBS HEAT INACT. S.AMERICAN | Fisher scientific | E3387M | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Fisher scientific | E3470C | |
| GLUTAMAX | Fisher scientific | E3524T | |
| TRYPSIN 0.05% EDTA | Fisher scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%, | Sigma aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | HARVARD APPARATUS | ||
| Photoresist | CIPEC SPECIALITIES | Résine AZ9260 |
References
- Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
- Gaillard, J. L., Finlay, B. B. Effect of cell polarization and differentiation on entry of Listeria monocytogenes into the enterocyte-like Caco-2 cell line. Infect. Immun. 64, 1299-1308 (1996).
- Anderson, J. M., Balda, M. S., Fanning, A. S. The structure and regulation of tight junctions. Curr. Opin. Cell Biol. 5, 772-778 (1993).
- Guttman, J. A., Finlay, B. B. Tight junctions as targets of infectious agents. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 832-841 (2009).
- Anderson, J. M. Molecular structure of tight junctions and their role in epithelial transport. News. Physiol. Sci. 16, 126-130 (2001).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Tight junctions: Closing in on the seal. Curr. Biol. 9, (1999).
- Ma, T. Y., Boivin, M. A., Ye, D., Pedram, A., Said, H. M. Mechanism of TNF-{alpha} modulation of Caco-2 intestinal epithelial tight junction barrier: role of myosin light-chain kinase protein expression. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 422-430 (2005).
- Schulzke, J. D., et al. Epithelial tight junctions in intestinal inflammation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1165, 294-300 (2009).
- Fisher, S. J., Swaan, P. W., Eddington, N. D. The ethanol metabolite acetaldehyde increases paracellular drug permeability in vitro and oral bioavailability in vivo. The J. Pharmacol. Exp. Therap. 332, 326-333 (2010).
- Ma, T. Y., Nguyen, D., Bui, V., Nguyen, H., Hoa, N. Ethanol modulation of intestinal epithelial tight junction barrier. Am. J. Physiol. 276, 965-974 (1999).
- Nemeth, E., Halasz, A., Barath, A., Domokos, M., Galfi, P. Effect of hydrogen peroxide on interleukin-8 synthesis and death of Caco-2 cells. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 29, 297-310 (2007).
- Vogelmann, R., Amieva, M. R., Falkow, S., Nelson, W. J. Breaking into the epithelial apical-junctional complex–news from pathogen hackers. Curr. Opin. Cell Biol. 16, 86-93 (2004).
- Nusrat, A., et al. Clostridium difficile toxins disrupt epithelial barrier function by altering membrane microdomain localization of tight junction proteins. Infect. Immun. 69, 1329-1336 (2001).
- Obert, G., Peiffer, I., Servin, A. L. Rotavirus-induced structural and functional alterations in tight junctions of polarized intestinal Caco-2 cell monolayers. J. Virol. 74, 4645-4651 (2000).
- Nagar, B., Overduin, M., Ikura, M., Rini, J. M. Structural basis of calcium-induced E-cadherin rigidification and dimerization. Nature. 380, 360-364 (1996).
- Boulenc, X., et al. Importance of the paracellular pathway for the transport of a new bisphosphonate using the human Caco-2 monolayers model. Biochem. Pharmacol. 46, 1591-1600 (1993).
- Artursson, P., Magnusson, C. Epithelial transport of drugs in cell culture. II: Effect of extracellular calcium concentration on the paracellular transport of drugs of different lipophilicities across monolayers of intestinal epithelial (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 595-600 (1990).
- Artursson, P. Epithelial transport of drugs in cell culture. I: A model for studying the passive diffusion of drugs over intestinal absorptive (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 476-482 (1990).
- Artursson, P., Karlsson, J. Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 880-885 (1991).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. J. Cell Biol. 134, 1031-1049 (1996).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Uchida, M., Fukazawa, T., Yamazaki, Y., Hashimoto, H., Miyamoto, Y. A modified fast (4 day) 96-well plate Caco-2 permeability assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 59, 39-43 (2008).
- Krug, S. M., Fromm, M., Gunzel, D. Two-Path Impedance Spectroscopy for Measuring Paracellular and Transcellular Epithelial Resistance. Biophys. J. 97, 2202-2211 (2009).
- Wegener, J., Abrams, D., Willenbrink, W., Galla, H. J., Janshoff, A. Automated multi-well device to measure transepithelial electrical resistances under physiological conditions. BioTechniques. 37, 592-594 (2004).
- Weber, C. R., Shen, L., Wu, L., Wang, Y., Turner, J. R. Occludin is Required for Tumor Necrosis Factor (TNF)-Mediated Regulation of Tight Junction (TJ) Barrier Function. Gastroenterology. 140, (2011).
- Owens, R. M., Malliaras, G. G. Organic electronics at the interface with biology. MRS Bull. , (2010).
- Lin, P., Yan, F., Yu, J. J., Chan, H. L. W., Yang, M. The Application of Organic Electrochemical Transistors in Cell-Based Biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).
- White, H. S., Kittlesen, G. P., Wrighton, M. S. Chemical Derivatization of an Array of 3 Gold Microelectrodes with Polypyrrole – Fabrication of a Molecule-Based Transistor. J. Am. Chem. Soc. 106, 5375-5377 (1984).
- Bernards, D. A., Malliaras, G. G. Steady-state and transient behavior of organic electrochemical transistors. Adv. Funct. Mater. 17, 3538-3544 (2007).
- Jimison, L. H., et al. Measurement of Barrier Tissue Integrity with an Organic Electrochemical Transistor. Adv. Mater. 24, 5919-5923 (2012).
- Tria, S., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Sensing of EGTA Mediated Barrier Tissue Disruption with an Organic Transistor. Biosensors. 3, 44-57 (2013).
- Tria, S. A., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Validation of the organic electrochemical transistor for in vitro toxicology. Biochim. Biophys. Acta. 1830, 4381-4390 (2013).
- Zhu, Z. T., et al. A simple poly(3,4-ethylene dioxythiophene)/poly(styrene sulfonic acid) transistor for glucose sensing at neutral pH. Chem. Commun. , 1556-1557 (2004).
- Lin, P., Yan, F., Yu, J., Chan, H. L., Yang, M. The application of organic electrochemical transistors in cell-based biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).
