유기 전기 트랜지스터와 장벽 조직 혼란의 감지
Summary
유기 전기 트랜지스터는 생균과 통합 위장관 상피 장벽을 가로 질러 이온 플럭스를 모니터링하는 데 사용된다. 본 연구에서, 칼슘 킬레이트 EGTA (에틸렌 글리콜 – 비스 (베타 – 아미노 에틸 에테르)-N, N, N ', N'-테트라 아세트산의 존재에 의해 유도 타이트 접합 중단, 관련된 이온 플럭스의 증가, 산)가 측정된다.
Abstract
위장관 필요한 이온 및 분자의 통과를 허용하면서, 병원체 및 독소의 엔트리에 대해 물리적 장벽을 제공 장벽 조직의 일례이다. 이 장벽에 위반 세포 외 칼슘 농도의 감소가 발생할 수 있습니다. 칼슘 농도의 감소는 세포층의 플럭스의 증가로 이어지는, 장벽의 밀봉에 관련된 단백질의 구조적 변화가 발생합니다. 이 효과를 모방하는 칼슘 킬레이트 에틸렌 글리콜 – 비스 (베타 – 아미노 에틸 에테르)-N, N, N은 ', N'-테트라 아세트산 (EGTA)은 위장관의 대표적인 것으로 알려진 세포의 단층에 사용 하였다. 장벽 조직의 파괴를 검출하는 다른 방법은 이미 면역 분석법 및 투과성으로 존재한다. 그러나 이러한 방법은 시간과 비용이 많이 들고 동적 또는 높은 처리량 측정에 적합하지 않습니다. 장벽 조직을 측정하기위한 방법으로 전자무결성은 또한 transepithelial 저항 (TER)의 측정을 위해 존재한다, 그러나 이들은 종종 비용이 많이 들고 복잡하다. 장벽 조직의 무결성이 약물 발견 및 병원체 / 독소의 진단에 중요한 매개 변수로, 신속 저렴하고 민감한 방법의 개발이 절실히 필요합니다. 장벽 조직 형성 세포와 통합 유기 전기 트랜지스터 (OECT)는 동적으로 차단 티슈 무결성을 모니터링 할 수있는 새로운 장치로서 도시되었다. 장치는 장벽 조직 무결성 지표로, 실시간으로, 지금까지없는 시간 분해능과 감도와 이온 플럭스의 미세한 변화를 측정 할 수있다. 이 새로운 방법은 높은 처리량 검사 응용 프로그램과 호환 및 저렴한 비용으로 제조 할 수있는 간단한 장치를 기반으로합니다.
Introduction
위장관 상피는 신체의 다른 구획 간의 분자의 통과를 제어하는 배리어 조직의 일례이다. 물과 몸을 유지하기 위해 필요한 영양소의 통과를 허용하면서 상피 세포는 병원체와 독소에 대한 물리적 장벽 1을 제공하는 단백질의 복합체에 의해 조인 긴 원주 세포로 구성되어 있습니다. 루멘과 하부 조직 2,3 정박 세포의 기저 측에 노출 된 세포의 정점 측이 선택은 두 개의 다른 멤브레인 도메인을 생성 상피 세포의 분극에 기인한다. 단단한 접합 (TJ)는 상피 세포의 꼭대기 부분에 존재하는 단백질의 복합체이며, 혀끝의 접합 4로 알려진 큰 단지의 일부입니다. 장벽 조직에서 이온의 흐름 (셀을 통해) 세포 횡단을 통해 또는 (두 개의 인접한 세포 사이) 세포층의 경로를 통해 갈 수도 있고. 화의두 경로를 통해 전송은 transepithelial 저항으로 알려져있다. 혀끝의 접합은 이온과 특정 열고 닫는 기능을 통해 장벽 5,6에 걸쳐 통과 분자의 규제에 대한 책임이 있습니다. 이 단백질 복합체의 기능 장애 또는 중단은 종종 질병 7-11에 관련되어 있습니다. 또한, 많은 장내 병원균 / 독소는 장벽 12-14에서 이온 / 물 흐름의 대규모 조절 장애의 결과로 대부분함으로써 몸을 입력하고 설사로 이어지는, 특히이 단지를 대상으로 알려져있다. 차단 티슈는 또한 세포 외 미세 환경을 변화시킴으로써 수정 될 수있다. 헤린은 세포 – 세포 접착에 중요한 단백질이며, 정점 접합의 형성에 관여한다. 칼슘 헤린의 정확한 구조적 형태를 위해 필요하며, 세포 외 칼슘의 감소는 세포 – 세포 접합의 파괴와의 후속 개구 초래할 것으로 나타났다셀 (15) 사이의 세포층의 통로. 그것이 갖는 한 본 연구에서는 EGTA (에틸렌 글리콜 – 비스 (베타 – 아미노 에틸 에테르)-N, N, N ', N'-테트라 아세트산), 특정 칼슘 킬 레이터는, 장벽 조직 위반을 유도하는 데 사용 된 이온은 16, 17 흐름 세포층에 신속하고 과감한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이 칼슘 킬레이트 화제가 된 Caco-2 세포 라인의 합류와 차별화 된 단층에 사용되었다. 세포 배양에서 배양 삽입물이 세포주는 위장관의 특성을 개발하는 것으로 알려져 있고 널리 18,19 약물의 흡수를 테스트하는 제약 산업에서 사용된다.
장벽 조직의 무결성을 모니터링하는 방법은 많다. 이러한 방법은 혀끝의 접합 (20)에있는 것으로 알려진 특정 단백질의 면역 형광 염색에 의존, 또는 장벽 조직에 일반적으로 불 투과성 형광 추적 분자의 정량화에 의존, 자주 광학 있습니다(21, 22). 라벨의 사용이 유물이 발생, 종종 비용과 분석 시간이 증가 할 수 있습니다 그러나, (즉, 형광 / 발색단없이) 라벨이없는 방법이 바람직하다. 장벽 조직의 전기, 레이블이없는 모니터링는 최근 동적 모니터링 방법 23로 떠오르고있다. 예를 들어 전기 임피던스 분광법 최근의 기술 진보는 transepithelial 저항 (TER), 전지 층에 걸쳐 이온 전도도의 측정을 측정 할 수있는 상업적으로 이용 가능한 주사 장치 (24, 25)의 개발을 허용했다.
유기 전자는 전자와 이온 캐리어를 모두 수행 할 수 전도성 고분자를 사용하여 전자 공학 및 생물학 (26, 27) (28, 29)의 세계를 인터페이스 할 수있는 독특한 기회를 만들었습니다. OECT 30 ~ 32을 사용하여 장벽 조직에서 위반을 탐지하는 새로운 기술은 최근에 도입되었다. 이 장치는 기존의 기술을 우리에 대해 유효성이 확인되었다Cellzscope를 사용하여 루시퍼 노란색 사용하여 면역, 침투성 분석 등의 장벽 조직 무결성 및 임피던스 분광을 평가하는 ED. 시험 된 모든 독성 화합물의 경우, OECT는 동일하거나 더 나은 감도로 작동하는 것으로 확인하고, 상기 기술에 비해 증가 된 시간 해상도와 하였다. 이 장치에서, PEDOT는 : PSS, 안정하고 생체 적합성 33,34 것으로 도시되어 전도성 중합체는 트랜지스터 채널의 활성 물질로서 사용된다. OECT은 전도성 고분자 채널의 양측에 소스 및 드레인 전극으로 구성된다. 이는이어서 장치의 필수적인 부분을 형성하고, 전해질과 접촉된다. 게이트 전극은 전해질 (도 1)에 침지하고, 양의 게이트 전압이 게이트에인가 될 때, 전해질에서 양이온 따라서 전도성 중합체를 탈 도핑와 소스 – 드레인의 변화의 결과로, 채널로 강제 현재. Device 따라서 인해 트랜지스터에 의해 증폭 이온 플럭스에 분 변화에 매우 민감합니다. 세포 배양 인서트상에서 성장한 세포 층은 게이트 전극과 전도성 고분자 채널 사이에 배치 하였다. 그대로 전지 층의 존재는, 드레인 전류 감소는 (: 영역에서 B로 전환 그림 2) 양이온 그대로 단층의 존재, 따라서 전도성 중합체로 입력하기위한 장벽으로서 작용한다. 독성 화합물의 존재하에, 장벽 조직 점진적 양이온 고분자 필름에 입력시키는와 (: 영역 (C)도 2)의 드레인 전류가 증가하고, 그 완전성을 잃을 것이다. 이 방법으로, 장벽 조직 위반은 단층 걸쳐 광속의 변조에 대응하는 드레인 전류의 변조에 의해 알 수있다. 이 장치는 실시간으로 전례가없는 시간 분해능과 감도와 이온 플럭스에 분 변화를 측정 할 수있다. 이 기술 줘야난 약물 검사, 질병의 진단 또는 장벽 모델을 쉽게 적용 할 수있는 기초 연구에 대한 독성의 도메인에 관심을. 이 방법은 또한 체외 모델의 유효성 검사가 생체 내 시험에서 대체 할 수 있습니다로, 동물 실험을 줄이기 위해 도움이 될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기법은 장벽 조직 무결성을 측정하는 생균과 유기 전기 화학 트랜지스터를 통합하는 새로운 방법을 제공한다. 이 기술의 주요 장점은 신속성과 감도, 또한 장벽 조직의 동적 모니터링 장치의 저비용이다.
이 방법은 살아있는 세포를 사용하기 때문에, 중요한 점은 그대로 장벽 층을 나타내는 단일 층을 사용해야하는 것입니다. 배리어의 파라미터는 세포주의 특성 중에 정?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 논문의 저자는 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.
Materials
| CLEVIOS PH 1000 | HERAUS CLEVIOS | ||
| AZ9260 resin | CIPEC SPECIALITIES | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique dutscher | 51705 | |
| 24-well cell culture plate BD Falcon | Dominique dutscher | 51705 | |
| STERICUP-GP PES 0.22 μM | Dominique dutscher | 51246 | |
| ADVANCED DMEM Marque GIBCO | Fisher scientific | E3434T | |
| FBS HEAT INACT. S.AMERICAN | Fisher scientific | E3387M | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Fisher scientific | E3470C | |
| GLUTAMAX | Fisher scientific | E3524T | |
| TRYPSIN 0.05% EDTA | Fisher scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%, | Sigma aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | HARVARD APPARATUS | ||
| Photoresist | CIPEC SPECIALITIES | Résine AZ9260 |
References
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