عملية الشفاء من الخلايا جرح ينطوي الاتجار بروتينات معينة ومقصورات التحت خلوية إلى موقع الإصابة غشاء الخلية. يصف هذا البروتوكول فحوصات لرصد هذه العمليات.
قدرة الخلايا المصابة للشفاء هو عملية الخلوية الأساسية، ولكن الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في خلايا الشفاء بجروح ولا يزال الغموض يكتنف. هنا يتم وصف فحوصات لرصد القدرة وحركية للشفاء من إصابة الخلايا المستزرعة التالية مترجمة. يصف البروتوكول الأول نهجا يستند إلى نقطة النهاية في وقت واحد لتقييم قدرة الخلايا إصلاح غشاء من مئات الخلايا. يصف البروتوكول الثاني نهج التصوير في الوقت الحقيقي لمراقبة حركية إصلاح غشاء الخلية في الخلايا الفردية بعد الاصابة المترجمة مع ليزر نابض. كما أصيب خلايا الشفاء ينطوي الاتجار بروتينات معينة ومقصورات التحت خلوية إلى موقع الإصابة، ويصف البروتوكول الثالث استخدام نهج نقطة النهاية أعلاه استنادا إلى تقييم واحد مثل الاتجار الحدث (الليزوزومية إيماس) في مئات من الخلايا في وقت واحد وجرح بروتوكول مشاركة يصف استخدام الليزر النبضي الإصابة جنبا إلى جنب مع صغار TIRFنسخة لرصد ديناميات مقصورات التحت خلوية الفردية في الخلايا المصابة في القرار المكانية والزمانية عالية. في حين تصف بروتوكولات هنا استخدام هذه الأساليب لدراسة العلاقة بين إصلاح غشاء الخلية وإيماس الليزوزومية في خلايا العضلات مثقف، يمكن تطبيقها على هذا النحو لأية خلية أخرى ملتصقة مثقف ومقصورة التحت خلوية من خيار.
يحافظ على غشاء الخلية على سلامة الخلايا من خلال توفير حاجز بين الخلية والبيئة خارج الخلية. A التحفيز الكيميائية والكهربائية والميكانيكية أو التي تتجاوز عتبة فسيولوجية طبيعية وكذلك وجود غزو مسببات الأمراض يمكن لكل نتيجة في إصابة غشاء الخلية وتثير رد فعل الخلوية اللاحقة لإصلاح هذا الضرر. البقاء على قيد الحياة هذه الإصابات لغشاء الخلية، والخلايا تمتلك آلية فعالة للإصلاح. هذه الآلية هي التي تعتمد الكالسيوم وينطوي الاتجار داخل الخلايا من البروتينات مثل annexins وMG53 وغيرها فضلا عن المقصورات التحت خلوية مثل الإندوسومات، الجسيمات الحالة، جولجي والميتوكوندريا الحويصلات المشتقة من غشاء الخلية أصيب 1-7. ومع ذلك، فإن تفاصيل تسلسل الأحداث الجزيئية والتحت خلوية المشاركة في إصلاح غشاء الخلية التالفة لا تزال غير مفهومة تماما.
يمكن فصل استجابة إصلاح الخلية في الأذنلاي والاستجابات في وقت متأخر. الردود في وقت مبكر، والتي تحدث في غضون ثوان إلى دقائق النطاق الزمني، مهمة بشكل كبير في تحديد طبيعة الاستجابات في وقت متأخر مما يؤدي إلى إصلاح الخلية ناجحة أو موت الخلية. وقد ساعدت المقايسات نقطة النهاية على أساس الأكبر تحليل الكيمياء الحيوية والخلوية إثبات تورط العمليات الجزيئية والخلوية في الإصلاح. ولكن، نظرا لعدم التجانس وسرعة الاستجابة إصلاح الخلوية، تفشل المقايسات نقطة النهاية لتقديم التفاصيل الحركية والمكانية للتسلسل الأحداث التي أدت إلى إصلاح. هي مناسبة النهج التي تمكن من إصابة تسيطر غشاء الخلية وتسمح برصد إصلاح غشاء الخلية والاستجابات المرتبطة التحت خلوية في القرار المكانية والزمانية عالية مثالي لمثل هذه الدراسات. هنا، وقد عرضت هذه النهج. اثنين من البروتوكولات وصف النهج لرصد حركية في الوقت الحقيقي من إصلاح غشاء الخلية والردود التحت خلوية المرتبطة بعملية الإصلاح في الخلايا الحية التالية ينج الليزرأوروغواي. كتكملة لهذه المقايسات التصوير الخلية الحية تستند، كما تم وصفها المقايسات نقطة النهاية التي توفر مقياسا على السكان لإصلاح رصد الخلايا الفردية وردود التحت خلوية المرتبطة بها. لإثبات فائدتها وقد استخدمت هذه الأساليب لمراقبة الاتجار وإيماس من الجسيمات الحالة في استجابة لإصابة غشاء الخلية.
إصابة غشاء الخلية في الجسم الحي يحدث نتيجة لمجموعة متنوعة من الضغوطات الفيزيولوجية ولقد تم تطوير العديد من الطرق التجريبية لتقليد هذه. وتشمل هذه إصابة غشاء الخلية من الخلايا الملتصقة عن طريق كشط لهم قبالة صحن أو الركض من خلال الضيقة تتحمل حقنة 9،10. بعد هذه …
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AR055686 وAR060836 وزمالة ما بعد الدكتوراه لم من قبل جمعية الضمور العضلي الفرنسية (AFM). يتم دعم مرفق التصوير الخلوية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HD040677.
HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
Glass beads | Sigma | G8772 | |
TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
Mounting media | Dako | S3023 | |
Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
Invitrogen | A-7816 | ||
DMEM | VWR | 12001-566 | |
FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |