Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione
Summary
Il processo di guarigione cellule feriti comporta tratta di specifiche proteine e dei compartimenti subcellulari al sito della lesione membrana cellulare. Questo protocollo descrive saggi per monitorare questi processi.
Abstract
La capacità delle cellule danneggiate per guarire è un processo cellulare fondamentale, ma i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella guarigione delle cellule feriti sono poco conosciute. Qui saggi sono descritti per monitorare la capacità e la cinetica di guarigione delle cellule in coltura dopo la lesione localizzata. Il primo protocollo descrive un approccio basato punto di fine di valutare simultaneamente cellule riparazione della membrana capacità di centinaia di cellule. Il secondo protocollo descrive un metodo di immagini in tempo reale per monitorare la cinetica di riparazione membrana cellulare in cellule singole seguenti lesioni localizzate con un laser pulsato. Come cellule di guarigione feriti comporta tratta di specifiche proteine e dei compartimenti subcellulari al sito della lesione, il terzo protocollo descrive l'uso di approccio basato punto finale di cui sopra per valutare uno di questi eventi traffico (esocitosi lisosomiale) in centinaia di cellule danneggiate simultaneamente e l'ultimo protocollo descrive l'uso di lesioni laser pulsato con micros TIRFcopia di monitorare le dinamiche dei singoli compartimenti subcellulari in cellule danneggiate ad alta risoluzione spaziale e temporale. Mentre i protocolli che seguono descrivono l'uso di questi approcci per studiare il legame tra riparazione membrana cellulare e lisosomiale esocitosi in cellule muscolari coltivate, possono essere applicate come tali per qualsiasi altra cellula in coltura aderente e compartimento subcellulare di scelta.
Introduction
Membrana cellulare mantiene l'integrità delle cellule, fornendo una barriera tra la cella e l'ambiente extracellulare. Uno stimolo chimico, elettrico o meccanico che supera la normale soglia fisiologica così come la presenza di agenti patogeni invasori può ogni risultato lesioni alla membrana cellulare e innescare una risposta cellulare successiva per riparare questa lesione. Per sopravvivere queste lesioni alla membrana cellulare, cellule possiedono un meccanismo efficiente per la riparazione. Questo meccanismo è dipendente dal calcio e coinvolge traffico intracellulare di proteine come MG53 annexins e tra gli altri, nonché compartimenti subcellulari come endosomi, lisosomi, Golgi vescicole derivate e mitocondri alla membrana cellulare feriti 1-7. Tuttavia, i dettagli della sequenza di eventi molecolari e subcellulari coinvolti nella riparazione membrana cellula danneggiata rimane poco compresa.
Risposta di riparazione del cellulare può essere segregato in un orecchioly e risposte tardive. Le prime risposte, che si verificano in pochi secondi in scala minuti di tempo, sono estremamente importante nel determinare la natura delle risposte tardive che portano alla riparazione delle cellule successo o la morte delle cellule. Analisi del punto di arrivo sulla base di analisi biochimiche e cellulari di massa hanno contribuito a stabilire il coinvolgimento di processi molecolari e cellulari di riparazione. Ma, a causa della eterogeneità e rapidità di risposta di riparazione cellulare, saggi punto finale non riescono a fornire i dati cinetici e spaziali della sequenza di eventi che portano alla riparazione. Approcci che consentono pregiudizio controllata di membrana cellulare e permettono di monitorare la riparazione della membrana cellulare e subcellulare risposte associate ad alta risoluzione spaziale e temporale sono ideali per tali studi. Qui, tali approcci sono stati presentati. Due dei protocolli descrivono approcci per monitorare le reali cinetica momento della riparazione membrana cellulare e le risposte subcellulari associati al processo di riparazione in cellule vive seguenti inj laserury. Come complemento a queste analisi basate imaging cellulare dal vivo, saggi punto finale sono anche stati descritti che forniscono una misura basata sulla popolazione per il monitoraggio riparazione delle singole cellule e le risposte subcellulari associati. Per dimostrare la loro utilità questi approcci sono stati utilizzati per monitorare il traffico e l'esocitosi dei lisosomi in risposta al danno membrana cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lesioni membrana cellulare in vivo verifica a causa di una varietà di stress fisiologici e diversi approcci sperimentali sono stati sviluppati per imitare questi. Questi includono il ferimento membrana cellulare delle cellule aderenti raschiando loro fuori il piatto o da passaging attraverso uno stretto 9,10 siringa foro. Seguendo tali lesioni guariscono le cellule in sospensione e non aderire alla matrice extracellulare, come avviene normalmente nel tessuto. Altri ancora, come l'uso di pori for…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni AR055686 e AR060836 e borsa di studio postdottorato al dC da Francese Distrofia Muscolare (AFM). L'impianto di imaging cellulare utilizzato in questo studio è sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni HD040677.
Materials
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
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