Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri
Summary
Iyileşme yaralı hücrelerinin hücre zarı gibi bir işlem yaralanma siteye özgü protein ve hücre içi bölmeler kaçakçılığı içerir. Bu protokol, bu süreçleri izlemek için deneyleri açıklar.
Abstract
Iyileşmek için yaralı hücrelerinin yeteneği temel bir hücresel süreçtir, ama şifa yaralı hücrelerde yer alan hücresel ve moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Burada deneyler lokalize yaralanma sonrası kültürlenmiş hücrelerin iyileşmesi yeteneği ve kinetik izlemek için tarif edilmiştir. İlk protokol hücre aynı anda yüzlerce hücre zarı tamir yeteneği değerlendirmek için bir uç nokta bazlı yaklaşım anlatılmaktadır. İkinci protokol, bir darbeli lazerle lokalize yaralanmasından sonra, tek tek hücrelerin hücre membran onarım kinetiğini izlemek için bir gerçek zamanlı görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Şifa yaralı hücreleri yaralanma siteye spesifik proteinler ve subselüler bölmeleri kaçakçılığı içerdiğinden, üçüncü protokolü aynı anda yaralı hücrelerin yüzlerce böyle bir kaçakçılık olayı (lizozomal ekzositoz) değerlendirmek için yukarıdaki uç nokta bazlı yaklaşımın kullanımı ve son protokolünü açıklar TIRF MICROS birlikte darbeli lazer yaralanma kullanımını tarifyüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte yaralı hücrelerin içindeki bireysel subselüler bölmelerinin dinamiklerini izlemek için kopyalama. Burada protokoller, hücre zarı ve tamir kültürlenmiş kas hücrelerinde lızozomal Ekzositoz arasındaki bağlantıyı incelemek için bu yaklaşımların kullanımını tarif olsa da, herhangi bir diğer yapışık kültürlenmiş hücre ve hücre altı bölme seçim için gibi uygulanabilir.
Introduction
Hücre membran hücre ve hücre-dışı ortam arasında bir bariyer sağlayarak hücre bütünlüğünü korur. Normal fizyolojik eşik gibi, istila eden patojenlere varlığını aşan bir kimyasal elektriksel veya mekanik uyarıcı hücre zarına zarar her bir sonuç, bu hasarı onarmak için bir sonraki hücresel tepkiye sebep olabilir. Hücre zarı, bu yaralanmalar hayatta kalmak için, hücreleri tamir için etkili bir mekanizmaya sahip. Bu mekanizma, kalsiyum bağımlıdır ve diğerlerinin yanı sıra bu ve MG53 anneksinler gibi proteinlerin hücre içi hem de örneğin yaralı hücre zarı 1-7 endozomlarda, lizozomlarda, Golgi türetilmiş veziküller ve mitokondri gibi hücre altı bölme içerir. Bununla birlikte, hasarlı hücre zarı ve tamiri ile ilgili moleküler ve hücre içi olaylar dizisinin ayrıntıları henüz tam olarak anlaşılamamıştır.
Hücrenin onarım tepkisi kulağına ayrılmış olabilirly ve geç yanıtlar. Dakikalık bir zaman ölçeği saniyeler içinde meydana gelen erken tepkiler, başarılı onarım hücresi ya da hücre ölümüne yol açan geç yanıtların doğasını belirlenmesinde son derece önemlidir. Toplu biyokimyasal ve hücresel analizine dayalı uç nokta tahliller tamir moleküler ve hücresel süreçlerin tutulumu kurulmasına yardımcı olmuştur. Ama nedeniyle hücresel onarım tepki heterojenliği ve süratine, uç nokta deneyleri onarmak yol açan olaylar dizisinin kinetik ve mekansal ayrıntıları sağlamak için başarısız. Hücre zarı kontrollü yaralanma etkinleştirmek ve hücre zarı onarımı ve yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte ilişkili subselüler yanıtları izlemek izin Yaklaşımlar ideal gibi çalışmalar için uygundur. İşte, bu tür yaklaşımlar sunulmuştur. Protokollerin iki lazer inj aşağıdaki hücre membran onarım gerçek zamanlı kinetik ve canlı hücrelerdeki onarım süreci ile ilgili hücre içi tepkileri izlemek için yaklaşımlar açıklarUry. Bu canlı hücre görüntüleme bazlı deneyler için bir tamamlayıcı olarak, uç nokta deneyler ayrıca tek tek hücrelerin ve ilgili hücre içi tepkileri izleme onarımı için bir nüfus tabanlı bir ölçüsünü sağlar tarif edilmiştir. Bu yaklaşımlar hücre zarı hasarına yanıt ticaretini ve lizozomların eksositosizini izlemek için kullanılmış olan kendi programını göstermek için.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo hücre zarı hasarı, fizyolojik stres çeşitli ve çok sayıda deneysel yaklaşım, bu taklit etmek için geliştirilmiştir oluşur. Bunlar çanak onları kazıyarak ya da dar bir delik şırınga 9,10 ile pasajlanarak yapışık hücrelerin hücre zarı yaralanmasına içerir. Gibi yaralanmalar sonrasında hücreler süspansiyonda iyileşmesi ve normal dokuda olduğu gibi hücre dışı matrisin yapışık değildir. Bu gözenek oluşturucu toksin kullanımı Yine bazıları, kimyasal ola…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Fransız Müsküler Distrofi Derneği (AFM) ile AD Sağlık Hibeler AR055686 ve AR060836 ve doktora sonrası dostluk Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan hücresel görüntüleme tesis Sağlık Hibeler HD040677 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.
Materials
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
References
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Blebbing confers resistance against cell lysis. Death Differ. 18, 80-89 .
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling. Cell Biol. 193, 455-464 (2011).
- Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).
- McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. Cell wound assays. Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).
- McNeil, P. L. Direct introduction of molecules into cells. Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).
- Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. Cell Biol. 168, 429-439 (2005).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. 388, 474-478 (1997).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. Current Protocols in Cell Biology. , 4.12.1-4.12.15 (2003).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Imaging single events at the cell membrane. Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).
