Dissektion der<em> Xenopus laevis</em> Neural Crest für<em> In-vitro-</em> Explantation Kultur oder<em> In vivo</em> Transplantation

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie premigratory Schädel Neuralleiste (NC) von Xenopus laevis neurulas sezieren. Diese Explantate können sich auf Fibronektin und in vitro kultiviert beschichtet werden, oder zurück in die Wirts Embryonen gepfropft wird. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen der NC-Epithel-Mesenchym-Übergang an, Migration und Differenzierung.

Abstract

Die Neuralleiste (NC) ist eine transiente dorsalen Neuralrohr Zellpopulation, die ein Epithel-Mesenchym-Übergang zu (EMT) am Ende Neurulation erfährt wandert ausgiebig gegen verschiedene Organe und unterscheidet in viele Arten von Derivaten (Neuronen, Glia, Knorpel und Knochen, pigmentierte und endokrine Zellen). In diesem Protokoll beschreiben wir, wie Sie die premigratory Schädel NC von Xenopus laevis Embryonen zu sezieren, um die NC-Entwicklung in vivo und in vitro zu untersuchen. Der Frosch-Modell bietet viele Vorteile, die frühe Entwicklung zu studieren, reichlich Chargen verfügbar sind, Embryonen entwickeln sich schnell, in vivo Gewinn und Verlust der Funktion Strategien ermöglichen Manipulation der Genexpression vor NC-Dissektion in den Geber-und / oder Host-Embryonen. Die NC-Explantate auf Fibronectin ausplattiert und in vitro-Studien verwendet werden. Sie kann für mehrere Tage in einem serumfreien definierten Medium kultiviert werden. Wir beschreiben auch, wie NC-Explantate zurück pfropfenin Wirts Embryonen für Studium NC Migration und Differenzierung in vivo.

Introduction

Die Neuralleiste (NC) ist eine transiente embryonalen Zellpopulation, die aus dem Neuralrohr Ende Neurulation in Wirbeltierembryonen entsteht. Die Signal-und genetischen Ereignissen, die NC-Spezifikation steuern so früh wie Gastrulation. Die NC ist an der Grenze zwischen der neuralen und nicht-neuralen Ektoderm durch Signale von umliegenden Gewebe Rücken angegeben. Am Ende der Neurulation, NC-Zellen durchlaufen eine Epithel-Mesenchym-Übergang zu (EMT) und Migration weitgehend im Embryo folgenden stereo Routen durch die Reaktion auf Umgebungsführungs Signale. Sobald sie ihr Ziel erreicht haben, unterscheiden sie sich in einer Vielzahl von Derivaten, z. B. Nervenzellen, Gliazellen, Knochen, Knorpel und pigmentierten Zellen ^1-5. Durch ihren Beitrag zu vielen Zelltypen und embryonalen Geweben, Mängel bei jedem Schritt der NC-Zellen Entwicklung, von der Induktion bis zur endgültigen Differenzierung, können angeborene Syndrome genannt neurocristopathies ⁶ verursachen. Experimental Manipulation der Entwicklungs NC in verschiedenen Stadien – Spezifikation, EMT, Migration und Differenzierung – wird unser Verständnis der neurocristopathies verbessern und die Gestaltung der potenziellen therapeutischen Strategien.

Die Xenopus laevis Embryo ist ein Modell der Wahl, um NC-Entwicklung zu untersuchen. Eine große Anzahl von Embryonen sind leicht zu erhalten, und externe Befruchtung ermöglicht den Zugang zu den ersten Schritten der Entwicklung. Viele Werkzeuge zur Verfügung, um experimentell manipulieren X. laevis embryonalen Entwicklung. Gene gain-of-function-und Zuschlags sind leicht zu Mikroinjektion einzelnen Zellen des frühen blastulas durchzuführen. Embryonale Gewebe können für die in vitro Reassoziation ^7-11 oder Back-Pfropfen Assays ^12,13 geschnitten werden.

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man sezieren premigratory Schädel NC in X. laevis spät neurulas, vor der Migration. Diese Explantate auf Fibronektin-coate kultiviert werdend Platten zu Migration und Differenzierung in vitro-Studie bei Versuchsbedingungen gesteuert. NC-Explantate können auch in normalen oder manipuliert Host Embryonen gepfropft, um ihre Migration und Differenzierung in vivo zu untersuchen.

Protocol

Experimente mit nationalen und europäischen Verordnung über den Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke und mit international etablierten Prinzipien der Vermeidung, Verminderung und Verfeinerung entsprechen. 1. Vorbereitung der Fibronektin-beschichteten Schalen 14 Pipette 500 ml von 10 mg / ml Kulturqualität Fibronektin in 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) verdünnt in ein Standard-Kunststoff-Petrischale (Ø 40 x 11 mm). Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde….

Representative Results

Wenn auf Fibronektin zogen, legen die Neuralleiste Explantate schnell (15-30 min) und der Explantation breitet sich flach innerhalb von 2 h (Abb. 1A). Nach 3-6 Stunden Zellen beginnen sich zu zerstreuen. Nach 24 h bei 15 ° C, haben viele Zellen begonnen, von dem Explantat (Fig. 1B und 1C) zu migrieren. Eigelb macht Zellen sehr unter Phasenkontrast (Abbildung 1B) hell ist. Handy Vorsprünge (filopodes und lamellipodes) eindeutig nach Phalloidin-Färbung…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Technik, um premigratory Schädel NC in X. laevis Embryonen Explantation. Die für die Experimente verwendeten Embryonen müssen robust sein und auch zu heilen. Verwerfen Charge von ungesunden Embryonen. Darüber hinaus wachsen Embryonen bei verschiedenen Temperaturen (von 12 bis 18-20 ° C), um Neuralleiste in Stufe 17 und nicht später herauszuschneiden. Nach der Stufe 17 kann Neuralleiste, die mit Kopf Mesoderm gemischt werden und kann nicht vollständig entfernt wer…

Materials

Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F4759-1MG
Bovine Serum Albumine. Fraction V	Euromedex	04-100-811-C	Lower quality grade may  be suitable for this application
Stainless Steel Insect Pins. Size 000	FST	26001
Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm	FST	11252-20