Dissecção<em> Xenopus laevis</em> Crista neural para<em> In vitro</em> Cultura Explant ou<em> In vivo</em> Transplante

Summary

Este protocolo descreve como dissecar crista neural craniana premigratory (NC) de Xenopus laevis neurulas. Estes explantes podem ser semeadas em fibronectina e cultivadas in vitro, ou enxertados em embriões hospedeiros. Esta técnica permite estudar os mecanismos da transição epitélio NC-to-mesênquima, migração e diferenciação.

Abstract

A crista neural (NF) é uma população de células do tubo neural dorsal transiente que sofre uma transição epitélio para mesênquima (EMT) no final de neurulação, migra extensivamente para vários órgãos, e diferencia-se em vários tipos de derivados de (neurónios, células da glia, cartilagem e osso, as células pigmentadas e endócrino). Neste protocolo, descrevemos como dissecar o premigratory craniano NC a partir de embriões de Xenopus laevis, a fim de estudar o desenvolvimento NC in vivo e in vitro. O modelo sapo oferece muitas vantagens para estudar o desenvolvimento precoce; lotes abundantes estão disponíveis, os embriões se desenvolvem rapidamente, no ganho vivo e perda de estratégias de função permitem a manipulação da expressão gênica antes NC dissecção em doador e / ou embriões de acolhimento. Os explantes de NC podem ser semeadas em fibronectina e utilizados para estudos in vitro. Eles podem ser cultivadas durante vários dias, num meio definido isento de soro. Nós também descrevem como enxertar explantes NC voltaem embriões de acolhimento para estudar a migração NC e diferenciação in vivo.

Introduction

A crista neural (NF) é uma população de células embrionárias transiente que surge a partir do tubo neural, no final de neurulação em embriões de vertebrados. Os eventos de sinalização e genéticos que controlam a especificação NC começar tão cedo quanto a gastrulação. O NC é especificado na fronteira entre o ectoderma neural e não neural por sinais de tecidos dorsais circundantes. No final da neurulação, células NC sofrer uma transição epitélio para mesênquima (EMT) e migrar extensivamente no embrião seguindo vias estereotipados por responder ao redor pistas orientadoras. Uma vez que eles chegaram ao seu destino final, eles se diferenciam em uma vasta gama de derivados, por exemplo, neurônios, glia, ossos, cartilagens e células pigmentadas ^1-5. Por causa de sua contribuição para muitos tipos de células e tecidos embrionários, defeitos em qualquer etapa do desenvolvimento NC células, a partir de indução de diferenciação final, pode causar síndromes congênitas nomeados neurocristopathies ^6. Emanipulação Xperimental do NC desenvolvimento em diferentes estágios – especificação, EMT, migração e diferenciação – irá melhorar a nossa compreensão da neurocristopathies e permitir desenho de estratégias terapêuticas potenciais.

O embrião de Xenopus laevis é um modelo de escolha para estudar o desenvolvimento NC. Um grande número de embriões são fáceis de obter, e fecundação externa dá acesso aos primeiros passos do desenvolvimento. Muitas ferramentas estão disponíveis para manipular experimentalmente X. laevis desenvolvimento embrionário. Gene ganho de função e knockdown são fáceis de realizar por microinjecting células individuais dos primeiros blástulas. Tecidos embrionários podem ser cortados para in vitro reassociation ^7-11 ou ensaios de back-enxerto ^12,13.

Neste protocolo, descrevemos como dissecar premigratory NC craniano em X. laevis neurulas final, antes da migração. Estes explantes podem ser cultivados em fibronectina coateplacas d para estudar a migração e diferenciação em controladas em condições experimentais in vitro. Explantes NC também pode ser enxertado em embriões hospedeiros normais ou manipuladas para estudar a sua migração e diferenciação in vivo.

Protocol

Experimentos cumprir com a regulamentação nacional e comunitária relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos e com princípios internacionalmente consagrados de substituição, redução e aperfeiçoamento. 1. Preparação de Pratos fibronectina revestidos 14 Pipetar 500 ml de 10 mg / ml de fibronectina de grau de cultura diluído em 1x tampão fosfato salino (PBS) para uma placa de Petri de plástico padrão (Ø 40 x 11 mm). Incubar a 37 °…

Representative Results

Quando plaqueadas em fibronectina, os explantes da crista neural anexar-se rapidamente (15-30 min) e o explante estende horizontalmente dentro de 2 horas (Figura 1A). Depois de 3-6 células hr começar a se dispersar. Em 24 horas, a 15 ° C, muitas células começaram a migrar a partir do explante (Figuras 1B e 1C). Yolk torna as células muito brilhante em fase de contraste (Figura 1B). Protuberâncias celulares (filopodes e lamellipodes) são claramen…

Discussion

Este protocolo descreve uma técnica fácil de explantar premigratory craniano NC em embriões laevis X.. Os embriões utilizados para tais experimentos precisam ser robusto e curar bem. Descarte qualquer lote de embriões saudáveis. Além disso, os embriões crescem a diferentes temperaturas (de 12 a 18-20 ° C), de modo a excisar crista neural na fase 17, e não depois. Após a fase 17, crista neural pode ser misturado com mesoderme cefálica e não pode ser removido completamente. Tecidos Xenopus c…

Materials

Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F4759-1MG
Bovine Serum Albumine. Fraction V	Euromedex	04-100-811-C	Lower quality grade may  be suitable for this application
Stainless Steel Insect Pins. Size 000	FST	26001
Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm	FST	11252-20