Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione<em> Chlamydia</em> Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

Summary

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Abstract

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Introduction

Le malattie infettive causate da specie del batterio Chlamydia intracellulare suscitare un peso importante sulla salute globale, tra cui malattia sessualmente trasmessa, malattia infiammatoria pelvica, la cecità, la polmonite e, eventualmente, l'aterosclerosi ^1-4. La capacità di Chlamydia di interagire con la cellula ospite, all'interno di un vacuolo (chiamato l'inclusione), è un fattore determinante per il loro successo infezione delle cellule e l'host. L'inclusione è un compartimento patogeno romanzo che permette la crescita da Chlamydia e viene modificato dinamicamente durante l'intero ciclo di sviluppo di 2-3 giorni di Chlamydia ^5. La natura obbligato intracellulare di chlamydiae presenta numerose sfide per la comunità di ricerca, in particolare per lo studio della biologia direttamente unico dell'inclusione. Un importante ostacolo è stata l'impossibilità di visualizzare in modo efficiente o Chlamydia intracellulare o la loro inclusione con approccio fluorescentees nelle cellule viventi. Una recente scoperta ha finalmente rivelato i mezzi per generare GFP che esprimono C. trachomatis ^6; tuttavia, questo risultato non ha ancora portato a un'etichettatura specifica dell'inclusione. Alcune tecniche sono state descritte per l'etichettatura di batteri e inclusioni ^7,8, ma soffrono di carenze quali la non specificità, transitorietà e la suscettibilità alle photobleaching. Una scoperta fondamentale per il nostro gruppo ha stabilito una nuova strategia per illuminare l'inclusione mediante GFP che esprimono cellule ospiti ^9. Questa strategia sfrutta razionalmente l'impermeabilità intrinseca della membrana inclusione di molecole maggiore di 520 Da ^10. Quando le cellule sono progettati per esprimere stabilmente una particolare proteina fluorescente citosolica (ad esempio, GFP o mCherry), inclusioni Chlamydia sono visibili con notevole chiarezza la loro completa esclusione di fluorescenza. Questa strategia di imaging inversa permette la visualizzazione immediata di inclusioni per tutti Chlspecie amydia e può essere facilmente adattato per la maggior parte delle cellule ospiti d'interesse. A dimostrazione della sua utilità, questo metodo è stato utilizzato in precedenza per rivelare e definire le vie di uscita per Chlamydia spp cellulari ^9.

Qui, abbiamo ulteriormente dimostra come si esegue questo metodo, e può essere sfruttata per ricavare dati quantitativi chiave su dinamiche di crescita inclusione. Inoltre, si può effettivamente sostituire costosi metodi di enumerazione base di anticorpi e può essere utilizzato in tandem con altre etichette fluorescenti, come mKate2 esprimono Chlamydia ^11. Questa potente combinazione di strumenti consente l'esplorazione delle proprietà fisiche della membrana inclusione chlamydial all'interno delle cellule ospiti vivente.

Protocol

1. Generazione di linee cellulari Host fluorescente Giorno 1. Cellule piastra 293T (o altra linea di confezionamento retrovirali) su 6 pozzetti a 2 x 10 6 cellule / Beh, per essere ~ 75% confluenti il giorno successivo. Se lo si desidera, da utilizzare piastre pozzetti in duplicato per ciascuna retrovirus. Giorno 2. Le cellule Aspirare e aggiungere 2 ml di terreno di coltura fresco (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutammina). Trasfettare le cellule con 5-8 mcg ciascuna di vettore retrovirale (co…

Representative Results

Le cellule di mammiferi che esprimono proteine ​​fluorescenti citosoliche (ad esempio, GFP) possono essere progettati per consentire l'illuminazione di inclusioni Chlamydia nelle colture cellulari, vivi infetti. Al momento l'infezione da Chlamydia, inclusioni sono facilmente visibili come macchie nere nelle cellule ospiti (Figura 1). La chiarezza di inclusioni-fluorescenza carente può essere sfruttata per l'identificazione automatizzata di inclusioni in numero…

Discussion

Qui si descrive la strategia sperimentale per la generazione di cellule ospiti fluorescenti per la visualizzazione in tempo reale e l'analisi delle inclusioni Chlamydia. Questo approccio visualizzazione vacuolo conferisce il potente capacità di illuminare, monitorare e quantitativamente misurare le proprietà dinamiche delle inclusioni clamidia tra popolazioni di cellule o in singole cellule nel corso del tempo. Inclusioni Chlamydia nelle cellule proteina marcata fluorescenti sono sorprendentement…

Materials

Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µm filters	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o phenol red	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534