視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em>クラミジア</em生細胞内>液胞の成長ダイナミクス
Summary
A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.
Abstract
The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.
Introduction
クラミジアは性感染症、骨盤内炎症性疾患、失明、肺炎、おそらくアテローム性動脈硬化症1-4を含む、世界の健康に大きな負担を惹起細胞内細菌の種によって引き起こされる感染症。液胞の中から、宿主細胞と相互作用するクラミジアの能力は、（封入と呼ばれる）、それらの成功した細胞の感染および宿主のための重要な決定要因です。包含は、クラミジアの成長を可能にし、動的にクラミジア 5の全体の2〜3日の発達サイクルを通じて変更された新たな病原性の区画です。クラミジアの偏性細胞内性質は直接含めることのユニークな生物学を研究するため、特に研究コミュニティに多くの課題を提示。主要なハンディキャップを効率的に蛍光アプローチによって、細胞内のクラミジアやその含有物のいずれかを可視化することができないことでした生きた細胞内のES。最近の発見は、Cを GFP発現を生成するための手段を最終的に明らかにしましたトラコーマ 6;しかし、この発見は、まだ包含の特異的な標識には至っていません。いくつかの技術は、細菌や介在物7,8の標識に記載されているが、彼 らは、このような光退色に対して非特異性、仮初や感受性などの欠点があります。私たちのグループによる重要な発見は、宿主細胞9 GFP発現を使用して含めることを照明するための新たな戦略を確立しました。この戦略は、合理的にダ10 520よりも大きい分子に包接膜の固有の不透過性を利用します。細胞を安定的に特定の細胞質の蛍光タンパク質（例えば、GFPまたはmCherryを）を発現するように操作された場合、 クラミジア介在物は、蛍光の彼らの完全な排除による著しい明快で見ることができます。この逆イメージング戦略は、すべてのクロロフィルのための介在物の即時の可視化を可能にしますamydia種と容易に関心のほとんど宿主細胞に適合させることができます。その有用性の実証として、この方法は、 クラミジア属 9のための細胞の出口経路を明らかにし、定義するために以前に使用されました。
ここでは、さらにこの方法が行われ、包接成長のダイナミクスについての重要な定量的データを得るために活用することができる方法を示しています。また、効果的にコストのかかる抗体ベースの列挙法の代わりにすることができ、そのようなクラミジア 11 mKate2発現などの他の蛍光標識と並行して使用することができます。ツールのこの強力な組み合わせは、宿主細胞を生きた内部クラミジア封入体膜の物性の探査を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、リアルタイムの可視化とクラミジア介在物の分析のための蛍光宿主細胞を生成するための実験的な戦略について説明します。この液胞の可視化手法は、点灯トラックと定量的に細胞の集団間または経時単一細胞におけるクラミジア介在物の動的特性を測定するための強力な能力を付与する。蛍光タンパク質標識細胞におけるクラミジア介在物が著しく十分に定義され?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Ian Clarke and P. Scott Hefty for the pGFP-SW2 and pASK-GFP-mKate2-L2 plasmids, respectively. We thank Paul Miller for technical assistance and Richard Stephens for other resources. This work was funded by NIH grant AI095603 (KH).
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
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