Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak<em> Chlamydia</em> Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde
Summary
A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.
Abstract
The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.
Introduction
Hücre içi bakteri Chlamydia türlerinin neden Bulaşıcı hastalıklar cinsel yolla bulaşan hastalık, pelvik inflamatuar hastalık, körlük, zatürre ve muhtemelen ateroskleroz 1-4 dahil olmak üzere küresel sağlığı üzerinde önemli bir yük, ortaya. Bir vakuol içinden, konakçı hücre ile etkileşime Chlamydia kabiliyeti (dahil olarak adlandırılır), hücre ve ev sahibi başarılı enfeksiyonu için kritik bir belirleyicidir. Içerme chlamydia büyümesini sağlayan ve dinamik Chlamydia 5 tüm 2-3 gün gelişimsel döngüsü boyunca değiştirilmiş yeni bir patojen bölme olduğunu. Klamidyalar ve zorunlu hücre içi doğası doğrudan dahil eşsiz biyoloji eğitimi için özellikle araştırma topluluğuna sayısız zorluklarla, sunar. Büyük bir handikap verimli hücre içi Klamidya veya floresan yaklaşımla kendi eklenmesi ya görselleştirmek için yetersizlik olmuşturcanlı hücrelerde es. Bir son keşif sonunda GFP C ifade oluşturmak için bir araç ortaya çıkarmıştır trachomatis 6; Ancak bu bulgu henüz dahil belirli etiketlenmesine yol açmamıştır. Bazı teknikler bakteri ve inklüzyonlar 7,8 etiketlenmesi için tarif edilmiştir, fakat bu ışıkla ağartma olmayan spesifite, geçicilik ve duyarlılık gibi bazı eksikleri vardır. Grubumuz tarafından anahtar keşif konakçı hücreleri 9 ifade GFP kullanarak içermenin aydınlatılması için yeni bir strateji kurdu. Bu strateji, rasyonel daha büyük 520 Da 10 molekülüne dahil membran iç sızdırmazlık patlatır. Hücreler stabil belirli bir sitozolik floresan proteini (örneğin, GFP veya mCherry) ifade etmek için tasarlanmıştır zaman Chlamydia inklüzyonlar floresan onların tam dışlama yoluyla kayda değer bir açıklıkla görebilir. Bu ters görüntüleme stratejisi, tüm Chl için kapanım derhal görselleştirme sağlaramydia türleri ve havaalanı en konakçı hücreler için adapte edilebilir. Kendi programını bir göstergesi olarak, bu yöntem Chlamydia spp 9 hücresel çıkış yollarını ortaya çıkarmak ve tanımlamak için önceden kullanıldı.
Burada, biz daha fazla bu yöntem gerçekleştirilir ve içerme büyüme dinamikleri hakkında önemli nicel veriler elde etmek için istismar edilebilir gösterilmektedir. Bundan başka, etkili bir şekilde pahalı antikor bazlı sayım yöntemleri yerine kullanılabilir ve bu tür Chlamydia 11 mKate2 ifade eden diğer floresan etiketler, ile birlikte de kullanılabilir. Araçlar Bu güçlü kombinasyon yaşayan konak hücrelerin içinde klamidya içerme zarının fiziksel özelliklerinin araştırılmasını sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada gerçek zamanlı görselleştirme ve Chlamydia kapanım analizi için floresan konakçı hücreleri üretmek için deneysel bir strateji açıklar. Bu vakuol görselleştirme yaklaşımı zamanla tek hücre hücre popülasyonlarında karşısında ya da klamidya kapanım dinamik özellikleri, aydınlatmak izlemek ve kantitatif ölçmek için güçlü yeteneği kazandırır. Klamidya kapanımlar floresan proteini etiketli hücrelerde çarpıcı iyi kolayca tespit edilir, öyle ki tanımlanır Ek …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Ian Clarke and P. Scott Hefty for the pGFP-SW2 and pASK-GFP-mKate2-L2 plasmids, respectively. We thank Paul Miller for technical assistance and Richard Stephens for other resources. This work was funded by NIH grant AI095603 (KH).
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
References
- Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, S380-S383 (1999).
- Schachter, J., Stephens, R. S. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. , 139-169 (1999).
- Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae–an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
- Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, S114-S125 (2010).
- Hackstadt, T., Stephens, R. S. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. , 101-138 (1999).
- Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258 (2011).
- Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
- Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
- Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
- Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949 (2012).
- Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090 (2013).
